风湿寒症型类风湿性关节炎动物模型滑膜CD3、CD21和CD68的表达

熊艳杰　裴银辉　朱玉芳　周芳媛　英艳飞　董素宁

华北理工大学　河北唐山　063000



风湿寒症型类风湿性关节炎动物模型滑膜CD3、CD21和CD68的表达

熊艳杰裴银辉朱玉芳周芳媛英艳飞董素宁

华北理工大学河北唐山063000

①目的探讨风湿寒症型大鼠类风湿性关节炎(RA)模型滑膜区域主要免疫细胞CD3、CD21、CD68的表达。②方法免疫组织化学方法检测风湿寒症型RA模型组(模型组)和对照组大鼠关节滑膜区域CD3、CD21和CD68的表达，分析该区域的主要免疫细胞成分。③结果模型组在造模后第21、28、35、42天CD3平均表达率呈逐渐上升趋势，第42天最高；且各时间点均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；模型组与对照组CD21在各时间点相比差异均无统计学意义(P>0.05)；模型组CD68在造模后第28天和35天的表达率高于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。④结论风湿寒症型RA动物模型滑膜区域炎细胞浸润有T淋巴细胞和巨噬细胞，而其中T淋巴细胞是主要免疫细胞，B淋巴细胞与RA局部滑膜组织的损伤无关。

类风湿性关节炎滑膜CD3CD21CD68

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、全身性免疫疾病，典型病变以关节滑膜炎及关节损坏和畸形为主，临床多表现为对称性及周围关节病变，病变可能侵犯全身各个器官如心脏、肝脏、脾脏、肾脏及动脉等[1]。RA最主要的病理表现为滑膜炎，其形态学特点为滑膜细胞的增生、衬里下层大量炎症细胞浸润、间质纤维化及新生血管形成等。随着基础和临床研究的进展，RA滑膜区域的免疫特性研究及重要炎症细胞在启动和维持滑膜免疫炎症反应中的作用受到更多风湿学界学者的关注，本研究将通过免疫组织化学方法检测RA动物模型滑膜区域CD3、CD21和CD68的表达，分析该区域的主要免疫细胞成分。

1　材料和方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物。5周龄雌性Wistar大鼠40只，体质量为(130.25±15.36)g，购自华北理工大学实验动物中心[动物许可证号：SCXK(军)2014-0001]。大鼠适应性喂养1周,随机分两组：模型组和对照组，每组20只。所有动物均在同等条件下喂养(动物房许可证号：SYXK2015-0038)，自由饮水进食，普通饲料定时定量喂养，选择光线充足，通风良好的实验环境下饲养。

1.1.2实验试剂。CD3抗体(ZM-0417)、CD21抗体(ZM-0525)、羊抗兔/小鼠二抗(PV6000)和DAB均购于中杉金桥生物技术有限公司；CD68抗体(RLM 3161)购于苏州睿瀛生物技术有限公司；卡介苗(上海瑞楚生物科技有限公司)；羊毛脂(中国嘉定华亭羊毛脂厂产品))；液体石蜡(天津市大茂化学试剂厂)。

1.2实验方法

1.2.1风湿寒症型RA动物模型造模方法。模型组大鼠右后足趾皮内注射弗氏完全佐剂(CFA) 0.1mL,同时将大鼠置于4℃冷水中,水深2cm,站立40分钟,同时伴以4级风力。除注射CFA外，其他风湿寒症处理每天1次,连续造模14天。对照组于大鼠右后足趾皮内注射生理盐水0.1mL,不进行其他处理。

1.2.2实验数据采集。每天记录大鼠一般状态，包括毛发、行动、进食及精神状态，耳、尾、足是否出现关节红肿及其他炎症反应。从造模第一天开始，分别在第 21、28、35、42天随机抽取两组大鼠各5只，测量并记录每只大鼠的体重和关节肿胀度；取大鼠右后肢踝关节，EDTA脱钙液脱钙约30天后脱水包埋制成病理蜡块行HE切片及免疫组化染色。

1.2.3CD3、CD21和CD68的免疫组化检测步骤。每个踝关节蜡块分别切片三张贴附于免疫组化粘附载玻片上，且每张切片下同时捞取扁桃体组织做阳性对照，滴加PBS代替一抗做阴性对照行免疫组织化学染色。69℃烤片2小时后分别进行CD3、CD21和CD68免疫组织化学染色，具体操作见二抗说明书进行。

1.3免疫组化结果判断CD3和CD21阳性表达均定位在细胞膜，细胞膜有棕黄色颗粒着色判为阳性细胞。CD68阳性表达定位在细胞浆，细胞浆有棕黄色颗粒着色判为阳性细胞。CD3和CD21两个抗体每张切片随机选取5个高倍视野，计数每个视野网格测微尺内每100个淋巴细胞中该抗体阳性细胞个数，得出阳性表达百分率，5个高倍视野阳性表达百分率/5得出每张切片该抗体阳性表达百分率均数；CD68阳性细胞百分率以整张切片滑膜增生细胞中的CD68阳性细胞数占细胞总数计算。

1.4统计学分析应用SPSS 11.5 软件进行统计学分析，多组均数比较应用单因素方差分析，两组均数比较采用t检验，检验水准取双侧α=0.05。

2　结果

2.1模型组大鼠表现模型组大鼠造模后3～21天，大鼠精神欠佳，右足爪红肿，右足趾皮下软组织逐渐肿胀，关节滑膜表现软组织慢性炎症，中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞增多；28天后大鼠轻度脱毛，食欲减退，体重无明显增长，足趾表面肿胀严重，皮肤开始溃烂，滑膜由单层变复层，滑膜组织增生水肿，新生血管增多，血管翳形成，慢性炎症明显；35天大鼠足趾表面肿胀减轻，皮肤溃烂严重，滑膜层次增多，关节腔间隙变窄，关节炎、纤维化明显；42天时，大鼠行动迟缓，足爪红肿减轻，可见踝关节及足趾畸形，关节软骨出现剥脱性病变，关节腔结构紊乱有炎性细胞浸润。对照组大鼠各阶段均无皮下肿胀及关节畸形现象，滑膜细胞无增生和水肿表现。结合大鼠关节和滑膜表现，说明风湿寒症型RA动物模型造模成功。

2.2模型组与对照组滑膜区域不同时间CD3、CD21和CD68的表达情况本实验中模型组大鼠关节滑膜炎组织中大量表达CD3细胞，部分表达在淋巴滤泡周围，阳性细胞胞膜呈棕黄色颗粒状，细胞核为蓝色(图a)；正常滑膜组织极少量表达CD3抗体。模型组CD3抗体在造模后第21、28、35、42天的平均表达率分别为54%、60%、74%和83%，呈逐渐上升趋势，第42天最高。第35天和第42天的表达率均高于第21天，差异有统计学意义(P<0.05)，且第42天与第28天相比差异亦有统计学意义(P<0.05)。模型组CD3抗体在造模后第21、28、35、42天的表达率均高于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表1。提示RA滑膜组织中T淋巴细胞数量增加，且RA的严重程度与T淋巴细胞浸润数量相关。

表1　模型组与对照组各时间点CD3、CD21和CD68的表达

注：与对照组比较，*P<0.05;与同组21天比较,△P<0.05；与同组28天比较,#P<0.05

关节滑膜炎组织淋巴滤泡中有部分细胞表达CD21抗体，阳性表达在细胞膜，在滤泡外其他淋巴细胞中也有散在阳性细胞表达(图b)；正常滑膜组织少许细胞表达CD21抗体。模型组CD21抗体在造模后第21、28、35、42天的平均表达率逐渐上升，分别为23%、35%、44%和51%，第42天最高。CD21抗体在造模后第21、28、35、42天，模型组与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。提示正常滑膜组织中亦有一定数量B淋巴细胞，B淋巴细胞在滑膜组织的浸润与RA局部滑膜组织的损伤无关。

滑膜炎组织淋巴滤泡中亦有散在细胞的细胞浆表达棕黄色颗粒，这些细胞表达CD68抗体，淋巴滤泡外围细胞散在阳性，另可见滑膜下层组织中少许星状细胞表达CD68抗体(图c)，提示滑膜炎组织中存在巨噬细胞；而正常滑膜组织细胞中只有极少量CD68抗体表达(图d)。模型组CD68抗体在造模后第21、28、35、42天表达率逐渐上升，分别为17%、28%、30%和31%，同样为第42天最高。CD68分子表达率在造模后第28天和35天模型组高于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)；在造模后第21天和42天，模型组与对照组相比差异没有统计学意义(P>0.05)，见表1。提示滑膜炎组织中巨噬细胞增多，可能参与RA滑膜组织炎症的形成与发展。

注：a：RA模型组滑膜组织CD3阳性表达；b：RA模型组滑膜组织CD21阳性表达；c：RA模型组滑膜组织CD68阳性表达；d：正常组阴性表达

图1模型组与正常组CD3、CD21和CD68免疫组化染色(IHC×400)

3　讨论

RA是以关节滑膜炎为特征，由多种免疫细胞及其分泌的细胞因子相互作用的一种自身免疫性疾病。 RA的病理表现为关节滑膜增生、炎性细胞浸润及渗出、血管翳形成，最终导致关节腔隙变窄，关节软骨剥脱破坏。关节的病变过程中有多种细胞参与导致炎症反应，例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、中性粒细胞及巨噬细胞的渗出和浸润。CD3是存在于胸腺细胞、静止和活化T淋巴细胞上的一种T细胞标记物，在95%以上的T细胞阳性表达，常用于总T细胞的标记，而B淋巴细胞、巨噬细胞、骨髓细胞及任何其他细胞均不表达。CD3是目前T细胞标记物的首选。CD21是人类疱疹病毒4型病毒的受体和B淋巴细胞的重要标记物,T淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞均不表达。CD68是巨噬细胞最可靠的标记物,这种抗原常在和溶酶体相关的胞浆蛋白中表达。本实验CD3抗体在风湿寒症型RA动物模型造模后第21、28、35、42天关节滑膜炎组织细胞呈阳性表达，其表达率呈逐渐上升趋势。模型组第42天，滑膜增生增厚、血管翳侵入关节腔内严重破坏关节软骨时CD3表达率最高；且模型组CD3在4个时间点的表达率均高于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)，提示滑膜炎组织中大量表达T淋巴细胞，且随着RA症状的加重，CD3表达率增加，T淋巴细胞炎细胞作用越明显。模型组滑膜炎组织中的淋巴滤泡及少数散在的炎性细胞表达CD21抗体，但在4个时间点与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)，提示正常滑膜组织中亦有一定数量B淋巴细胞，B淋巴细胞在滑膜组织的浸润与RA局部滑膜组织的损伤无关。模型组CD68抗体表达率在造模后关节炎症最重时期即造模第28天和35天高于对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)；在第21天和42天差异无统计学意义，提示模型组滑膜炎组织中巨噬细胞增多，可能参与炎症的形成与发展。这与Fabien Dépis等报道相一致[2]，提示T淋巴细胞和巨噬细胞均参与了RA关节滑膜炎症发生发展的过程，但是T淋巴细胞是最主要的炎症因子。

T淋巴细胞受外界抗原刺激分泌多种细胞因子并释放从而使机体产生细胞免疫应答。在T淋巴细胞的作用中，CD4+T 细胞亚群(Th细胞) 可能在RA的发病机理中扮演重要角色[3]。根据细胞分泌因子的作用，Th细胞可分为Th0细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞及调节性T细胞(Treg细胞)。Th0细胞为Th1细胞和Th2细胞的前体细胞，由白细胞介素(IL)-12等细胞因子分化而来；Th1细胞主要分泌的细胞因子有IL-2、IL-12、IFN-γ(γ干扰素)、TNF(β肿瘤坏死因子)等，参与细胞免疫的调节并辅助细胞毒性T细胞和单核巨噬细胞的分化[4]，介导细胞免疫应答引起炎性细胞因子的产生，导致炎症的产生；Th2主要分泌抑炎细胞因子如IL-4、IL-6和IL-10等,其具有增强由B淋巴细胞介导的体液免疫应答的作用，促进IgE的产生,嗜酸性粒细被激活，从而产生抗炎细胞因子[5,6]；Th17细胞是不同于Th1细胞和Th2细胞的一种Th细胞亚群[7]，它分泌IL-17促炎细胞因子，通过破骨细胞生成和诱导基质金属蛋白酶(MMPs),促进关节滑膜炎症和骨损伤致关节畸形[8,9];而Treg细胞亦是近年来研究的一种特殊的细胞亚群，它释放的抑制性细胞因子(TGF)-β和IL-10参与调控RA中的炎症性免疫应答过程，且Th17和Treg细胞可能在微环境细胞因子的作用下相互转化，调节Th17/Treg之间的平衡是RA治疗的一个重要研究目标[10]。本课题目前只分析出RA滑膜区域炎性因子的渗出和浸润主要为T淋巴细胞，其主要作用机制还有待进一步实验研究。除了T淋巴细胞与RA关节滑膜炎的发生和发展有重要联系，在RA早期病理变化中，滑膜炎症细胞中巨噬细胞在细胞因子的激活下，在炎症组织局部增多聚集，亦与滑膜细胞的增生水肿及血管翳的形成有关[11]。本实验中CD68标记的巨噬细胞在滑膜增生细胞和局部炎性组织中均有增多，随着RA症状的加重，巨噬细胞表达量越高，血管翳对关节软骨的破坏越严重，且在模型组滑膜炎症最重及血管翳形成时期CD68与对照组相比差异具有显著性，提示巨噬细胞与RA滑膜炎的发生和进展相关。

综上所述，风湿寒症型RA大鼠模型滑膜炎组织中T淋巴细胞和巨噬细胞增多，而RA的严重程度与T淋巴细胞浸润数量相关，提示T淋巴细胞是RA滑膜区域的主要免疫细胞。而B淋巴细胞在滑膜组织的浸润与RA局部滑膜组织的损伤无关，虽然模型组大鼠在造模后B淋巴细胞有较高的表达，但其与对照组比较差异无统计学意义，只能说明滑膜炎性细胞有B林巴细胞的渗出，其作用不是很明显，这与吴桂英[12]的研究不一致，因此，确切的研究结果尚需今后的进一步实验证实。

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(2016-03-31收稿)(张爱国编辑)

The expression of CD3,CD21,CD68 in synovial membrane of rheumatic cold symptoms type of RA rat models

XIONGYanjie,PEIYinhui,ZHUYufang,etal

(NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

ObjectiveTo discuss the expression of the major immune cells in synovial membrane of rheumatic cold symptoms type of RA rat models.MethodsIHC was performed to detect the expression of synovial membrane of CD3,CD21,CD68 in RA model group and normal group.Analyzed the main immune cell components in the regional of synovial membrane.ResultsThe average expression rate of CD3 antibody in model group was gradually increasing in the 21th,28th, 35th and 42th day after modeling,and the highest was the 42th day.Compared with the normal group, the model group had significant difference at the 21th,28th, 35th and 42th day after modeling(P<0.05);Compared with the normal group,the average expression rate of CD21 in model group had no significant difference at the four stages(P>0.05),the expression of CD68 in model group at the 28th and 35th day were higher than the normal group,the difference was significant(P<0.05).ConclusionThe inflammatory cells in the synovial membrane of RA has T lymphocytes and macrophages, and B lymphocytes are not related to the local synovial tissue of RA, but T lymphocytes are the main immune cells of RA.

Rheumatoid arthritis.Synovial membrane.CD3.CD21.CD68

熊艳杰(1989-)，女，研究生。研究方向：临床免疫。

裴银辉。

R 392

A

2095-2694(2016)04-259-05