粗提牛白细胞抗菌肽对冷藏肉的抑菌效果观察

朱文明，潘旭辉，郭珍珍，王亚宾,2，胡 慧,2，陈丽颖,2

(1.河南农业大学牧医工程学院, 河南 郑州450002； 2.河南省动物性食品安全重点实验室,河南 郑州450002)

粗提牛白细胞抗菌肽对冷藏肉的抑菌效果观察

朱文明1，潘旭辉1，郭珍珍1，王亚宾1,2，胡 慧1,2，陈丽颖1,2

(1.河南农业大学牧医工程学院, 河南 郑州450002； 2.河南省动物性食品安全重点实验室,河南 郑州450002)

为探讨粗提牛白细胞抗菌肽对冷藏肉的抑菌效果，通过牛白细胞粗提抗菌肽的制备、粗提抗菌肽的抑菌活性测定与最小抑菌浓度(MIC)测定、生鲜猪肉冷藏期间菌落总数的变化测定和抗菌肽对冷藏肉保鲜效果的观测，对添加粗提抗菌肽的生鲜猪肉在冷藏期间菌落总数的变化进行了研究。结果显示，牛白细胞抗菌肽对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)均具有明显的抑菌活性；粗提抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC均是0.619 μg·μL-1；生鲜猪肉样品在冷藏过程中的自身菌落变化规律是前期保持细菌正常钟形生长曲线，随着冷藏时间的延长，嗜冷细菌逐渐适应开始另一段生长趋势；在表面喷洒粗提抗菌肽后108 h内，冷藏肉的感官指标明显优于对照组，其菌落总数也比对照组有显著降低(P<0.05)，抑菌率维持在60%～99%，效果最高时可达99%。研究结果表明粗提牛白细胞抗菌肽可以有效抑制冷藏肉中的细菌增殖，可延长冷藏肉的保存期限，具有良好抑菌效果。

白细胞；抗菌肽；冷藏肉；抑菌效果；防腐保鲜

抗菌肽(Antibacterial Peptide, ABP)又称抗微生物肽(Antimicrobial Peptide, AMP)或肽抗生素(Peptide Antibiotics)，广泛分布于细菌、病毒和各种动植物体内，是生物天然免疫防御系统的重要组成部分[1]。研究表明，抗菌肽抗菌肽对绝大多数革兰阴性菌和革兰阳性菌有显著的抗菌活性，不易引起耐药性，有望作为抗生素的替代物[2]；并且抗菌肽对病毒、真菌甚至寄生虫也有一定的杀伤作用[3-4]。尤其是抗菌肽仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞[5]，还具有调节先天免疫和中和内毒素的功能等优点，因此抗菌肽有望开发成为新一代抗细菌、真菌、抗病毒和抗癌药物，具有开发价值和应用前景。另有研究表明，血中性白细胞的粗提液存在抗菌活性的主要原因是由于其中的内源性抗菌多肽类物质富含脯氨酸和精氨酸[6]。然而在粗提液中也存在其他的抗菌成分如较大的免疫相关蛋白的小碎片[7]。冷藏肉的保鲜一直是制约肉类食品食用安全的关键因素，而化学防腐剂本身存在着毒副作用或对人体健康具有潜在危害，其应用受到各种限制。抗菌肽因其绿色、天然、无毒害的特质而有望被开发为新型食品防腐保鲜剂。其中，来自乳酸菌的细菌素——乳球菌肽(Nisin)对多种革兰氏阳性菌有强烈抑制作用，已在乳制品加工、酒精饮料生产等方面得到广泛应用[8]。本研究利用从牛血液的白细胞中分离、提取的抗菌肽进行体外抗菌活性试验，并应用该粗提物进行了冷藏肉防腐保鲜效果观察，以期为进一步开发新的肉品保鲜材料和保鲜方法提供理论依据。

1 材料与方法

1.1标准菌种和抗生素标准品

大肠杆菌(E.coli)ATCC43895和金黄色葡萄球菌(S.aureus) 1056MRSA，由本实验室保存。安普霉素、氨苄青霉素标准品购自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.2生鲜肉样品

新鲜猪里脊肉购自冷鲜肉超市，去脂肪、筋腱，根据试验需要分割成质量及表面积大致相同的肉块，放入保鲜盒中，于(4.0±0.5)℃冰箱中储藏。全过程均在无菌条件下进行。

1.3牛白细胞抗菌肽的粗提取

提取抗菌肽参考陈丽颖等[9]的方法。临用时用0.01 %醋酸溶液稀释至抗菌肽蛋白质量浓度为3.13 g·L-1。

1.4粗提抗菌肽的平板抑菌试验

本试验采用微量琼脂糖弥散法[10]。取抗菌肽粗提液和对照抗生素溶液，分别作用于对数生长期的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌受试菌株。同时设0.01 %乙酸为阴性对照。经37 ℃过夜后测量各孔的抑菌圈直径。并按下列公式计算抑菌活性单位。

抑菌活性单位=[抑菌环(圈)直径(mm)-2]×10

1.5粗提抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC)测定

本试验采用96孔微量反应板法[11]测定药物和粗提抗菌肽的最小抑菌浓度。

1.5.1 细菌的准备 该试验使用对数生长期的标准大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌株。将标准大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌株的菌种各50 μL接种在5 mL的LB培养基中，37 ℃恒温摇床摇菌过夜培养所得。

1.5.2 抗菌肽与药物的准备 取白细胞粗提抗菌肽，用0.01%醋酸溶液稀释至抗菌肽蛋白质量浓度为3.13 mg·mL-1。将各抗生素用生理盐水稀释，使每个药物质量浓度为320 μg·mL-1。4 ℃冰箱保存备用。

1.5.3 MIC测定 将对数生长期的标准大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌株菌液稀释后加入于96孔板中，第1孔加入126 μL菌液，剩余7孔分别加入70 μL菌液。第1孔加入14 μL粗提抗菌肽溶液，混匀；吸出70 μL到第2孔，混匀；吸出70 μL到第3孔，混匀；如此依次稀释到第8孔，弃去70 μL。用保鲜膜密封好，37 ℃静置过夜(12～16 h)。对照组加入的为稀释好的药液(氨苄青霉素)14 μL。观察结果，以≥50 %生长受抑制者为阳性，根据出现阳性孔的最高稀释倍数计算MIC。每个菌株做2次重复，取平均值，即得到氨苄青霉素和抗菌肽的MIC。

1.6生鲜肉冷藏期间菌落总数的变化测定

该试验主要采用食品细菌菌落总数测定的方法。过程如下。从将冷藏肉放入冰箱开始计时(以0 h计)，每隔12 h(共8个时间点至84h)取样一次进行菌落总数测定。测定方法按GB/T 4789.2—2010[12]进行并作适当调整，本试验中取样量为10 g，培养条件为37 ℃需氧培养，36 h后取出进行菌落计数。根据试验所得数据，绘制细菌生长曲线。

1.7抗菌肽对冷藏肉的保鲜作用观察

根据所测得的粗提抗菌肽MIC和细菌生长曲线，结合具体的实际应用，将粗提抗菌肽应用于冷藏的生鲜猪肉，观察其保鲜效果。

1.7.1 材料处理 粗提抗菌肽使用液：临用时用0.01 %无菌乙酸溶液稀释粗提抗菌肽至1倍MIC浓度。自制喷瓶，并设定其一次喷涂的面积。使用前以75 %酒精浸泡灭菌，然后用0.01 %无菌乙酸溶液冲洗。

将生鲜猪肉分为2组，每组10块。用灭菌喷瓶将粗提抗菌肽使用液均匀喷涂于各肉块表面，对照组肉样喷洒同体积的0.01%无菌乙酸溶液。然后分别置于无菌保鲜盒中摆放均匀，用聚乙烯保鲜膜封口包好，放入(4.0±0.5)℃冰箱中冷藏。

1.7.2 菌落总数测定 按照前述方法取样并进行菌落总数测定，计数后计算粗提抗菌肽的抑菌率。同时观察并记录试验组和对照组肉样的感官变化。

抑菌率=[(对照组-试验组)/对照组]×100 %

2 结果与分析

2.1粗提抗菌肽的提取量

通过氯化铵裂解红细胞、搅拌器破碎白细胞和离心除去杂质等方法从所采集的牛血中分离提取到粗提物40ml，即粗提抗菌肽的产量为 0.001 3 mL·mL-1。将干粉溶于的0.01 %乙酸溶液中，经分光光度计进行蛋白质量浓度测定为41.395 g·L-1。

2.2粗提物的抑菌活性测定

微量琼脂糖弥散试验抑菌圈直径见表1。试验表明，制备的粗提牛白细胞抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有抑菌作用，而对大肠杆菌的抑菌作用更强，这与其它文献报道一致[13]。

表1 粗提抗菌肽和抗生素的抑菌圈直径

2.3粗提物的最小抑菌浓度(MIC)测定

本试验用来检测所获抗菌肽的最小抑菌浓度，对照药品为氨苄青霉素。表2所示为96孔微量反应板在药物作用下的长菌孔。

表2 氨苄青霉素和粗提抗菌肽的MICTable 2 MIC of crude extract from antimicrobial peptides and the AMP

2.4冷藏条件下肉样中菌落总数的变化动态

经测定，冷藏肉在0、12、24、36、48、60、72、84 h的菌落总数变化结果如图1所示。

图1 生鲜猪肉冷藏期间的菌数变化动态Fig.1 Dynamic states of colony counts in chilledraw pork during preservation

检测结果表明，冷藏肉的细菌数目变化基本符合细菌的生长曲线规律，而同时具有自己独有的特点，在形成一个钟形生长曲线后，细菌总数又有了快速上升。

另外，从感官上看，冷藏肉在放入4 ℃冰箱72 h后开始出现发粘，肉色变暗，并且已略显臭味。

2.5粗提抗菌肽对冷藏肉的保鲜效果

试验组和对照组冷藏肉在0、12、24、36、48、60、72、84、96、108 h的菌落总数测定结果表3所示。

表3 不同处理肉样在冷藏期间的菌落总数Table 3 Colony counts of treated samples during preservation

由表3可以看出，试验组和对照组的菌数变化总体趋势一致，但使用1倍MIC处理的实验组肉样菌落总数均明低于喷洒0.01 %乙酸溶液的对照组。经数据分析，粗提抗菌肽的抑菌率为60 %～99 %，具有显著性差异(P<0.05)，而且在12～48 h之间抑菌效果最佳(图2)。而从菌数随时间的变化上来看，试验组在72 h时菌数才达到与对照组36 h菌数相当的水平，这说明，粗提抗菌肽可延缓冷藏肉中的细菌增殖，由此可推测使用粗提抗菌肽能延长保质期约36 h。

图2 粗提抗菌肽在不同时间点的抑菌率Fig.2 Inhibition rate of crude AMP extracts atdifferent time points

另外，试验组和对照组肉样的感官变化也明显不同。对照组在冷藏24 h时便可闻到变质臭味，同时出现肉色变暗、肉样略发粘的现象，研磨后肉样稀释液也发黄偏暗，随冷藏时间的延长，该类情况在缓慢加剧后趋于稳定；而试验组在冷藏60 h后才逐渐出现类似情况。

3 小结与讨论

本研究表明，粗提牛白细胞抗菌肽可以有效抑制冷藏肉中的细菌增殖，可延长冷藏肉的保存期限，具有良好的应用前景。粗提物的抑菌活性测定和MIC测定为验证性试验，通过该试验确定了牛白细胞粗提抗菌肽具有良好的抗菌活性。

从本研究结果可知，生鲜肉冷藏期间菌落总数的变化和常规培养条件下细菌的生长曲线不一样。冷藏肉中的菌数在形成一个钟形生长曲线后，细菌总数又有了上升。新鲜肉品自购买、处理后在4 ℃冰箱保存，根据细菌生长规律，出现了图1中0～60 h期间图像；但肉品所含细菌种类多样，在冷藏过程中各种嗜温细菌逐渐死亡，随后各种嗜冷细菌逐渐大量增殖并成为优势菌群，图1中60 h后的菌数变化动态便体现了这一变化。抗菌肽对冷藏肉的保鲜作用从结果来看和预期效果存在一定的差距，这或许要归因于随着冷藏时间的延长，肉中所含嗜温菌和冷营菌群的菌相交替现象。

目前市场上的防腐保藏剂种类繁多，但大多都对人体有一定的毒害作用。本试验采取在冷藏肉表层喷洒抗菌肽粗提取物的方法来延长生鲜肉的保藏时间。总体上来看，抗菌肽在1倍MIC的浓度下即对冷藏肉保鲜具有明显的促进作用，且抑菌效果很显著，可有效延长肉品的保鲜期。这对于今后开发抗菌肽制品作为生物防腐剂、保鲜剂具有良好的参考价值。

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(责任编辑：蒋国良)

To explore the crude extract of frozen meat of bovine leukocyte antimicrobial peptides inhibitory effect, including the preparation of antimicrobial peptides of bovine leukocyte crude extract, crude extracts antibacterial activity of antimicrobial peptides determined the minimum inhibitory concentration (MIC) determination of the total number of colonies change during the determination of chilled fresh pork and antimicrobial peptides observations of the effect of frozen meat preservation. The results showed that bovine leukocyte antimicrobial peptides against gram-negative bacteria (E.coli) and Gram -positive bacteria ( Staphylococcus aureus ) had obvious antibacterial activity; crude extracts antimicrobial peptides on Escherichia coli and Staphylococcus aureus MIC were 0.619 μg·μL-1;the colony variation of fresh pork samples were frozen during the early phase of bacterial growth normal bell curve, with the extension of frozen time, psychrotrophic bacteria gradually adapt to start another period of growth trends. After spraying the surface of the crude extract of antimicrobial peptides within 108 h, frozen meat sensory indicators were significantly better than the control group.The total number of colonies was also significantly lower than in the control group(P<0.05),and the inhibitory rate was generally maintained at 60 % to 99%, the highest 99 %. These results indicate that the crude extract of bovine leukocyte antimicrobial peptides can inhibit the proliferation of bacteria in frozen meat, to extend shelf life, with good antibacterial effect.

leukocyte; antibacterial peptides; chilled meat; bacteriostatic effect; preservation

2015-11-20

河南省科技攻关项目(122102110042)；河南省教育厅重点科技攻关项目(152102310081)

朱文明(1994-),男,河南罗山人,硕士研究生,从事动物性食品安全及肉类防腐保鲜研究。

陈丽颖(1967-)，女，河南南阳人，教授，博士，硕士研究生导师。

1000-2340(2016)04-0512-04

S852

：A

Observationofbacteriostaticeffectonchilledmeatbyantimicrobialextractfrombovineleukocytes

ZHU Wenming1, PAN Xuhui1, GUO Zhenzhen1, WANG Yabin1,2, HU Hui1,2, CHEN Liying1,2(1.Engineering College of Animal Husbandry and Veterinary Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002，China; 2. Henan Key Laboratory for Animal-Derived Food Safety, Zhengzhou 450002,China)