牛磺胆酸钠对照品标定方法的建立

汪祺，何轶，郑笑为，姚令文，刘燕，戴忠，马双成

(中国食品药品检定研究院，北京 100050)

·基础研究·

牛磺胆酸钠对照品标定方法的建立

汪祺，何轶，郑笑为，姚令文，刘燕，戴忠*，马双成*

(中国食品药品检定研究院，北京 100050)

目的：采用多种技术手段建立牛磺胆酸钠对照品标定技术方法。方法：采用紫外光谱、红外光谱、核磁共振波谱(包括1H-和13C-NMR)进行结构确认；用薄层色谱法和高效液相色谱法进行纯度检查；用质量平衡法进行定量分析，并采用定量核磁技术对赋值结果进行验证。其中首次采用热重/差热分析(TG/DTA)和气相色谱-质谱(GC/MS)联用系统对牛磺胆酸钠原料中残留溶剂进行快速筛查。结果：牛磺胆酸钠原料经薄层色谱法及高效液相色谱法测定，纯度达到99.16%；质量平衡法赋值结果87.9%，定量核磁共振法的验证结果为87.9%。结论：牛磺胆酸钠对照品原料的定性鉴别结果符合要求，定量赋值结果准确、可靠；能够用于含量测定用对照品分发、使用。

牛磺胆酸钠；对照品标定；定性鉴别；质量平衡法；定量核磁共振技术

牛磺胆酸钠对照品来源为牛科动物牛BostaurusdomesticusGmelin的干燥牛胆粉进行成盐处理形成牛磺胆酸钠盐。目前应用涉及标准为2015版《中华人民共和国药典》(《中国药典》)牛黄蛇胆川贝液、蛇胆川贝胶囊、蛇胆陈皮片、蛇胆陈皮胶囊等项下的鉴别或含量测定用，应用较为广泛。由于牛磺胆酸钠在成盐处理过程中进行了碱化处理，加入过量钠元素以保证成盐完全，从而满足定值要求，因此在对其原料进行对照品标定过程中，需采用多种技术手段进行结构确认、纯度检查，最终定量赋值。

1 仪器、试剂与供试品

1.1 仪器

Waters 2695-2996 PDA系统；薄层色谱自动点样仪(卡玛公司)；库伦水分测定仪(METTLER公司)；Agilent 6410B液相色谱系统串联6410 Triple Quad四级杆质谱仪；Agilent 7890气相色谱仪；Nicolet iN10MX红外光谱仪(Thermo公司)；Bruker AV-Ⅲ-500核磁共振波谱仪(500Hz)；X-5显微熔点仪；NETZSCH STA4493F3 热重分析仪(天平灵敏度：0.1 μg，温度范围：室温～2000 ℃)。气质联用系统：气相系统为Agilent Technologies 7890B-GC system；质谱系统为Agilent Technologies 7000C GC/MS Triple Quad。

1.2 试剂与供试品

高效液相色谱中采用的乙腈和甲醇均为HPLC级(fisher公司)，水采用Millipore纯化水系统制备，磷酸二氢钾、磷酸均为分析纯，薄层色谱应用中的正丁醇、冰醋酸、异丙醇、甲醇均为分析纯。供试品为待标化的牛磺胆酸钠对照品原料，来源为牛科动物牛BostaurusdomesticusGmelin的干燥牛胆粉。对照品为牛磺胆酸钠对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110815-201309，纯度87.8%；批号：110815-201308，纯度88.9%)。

2 方法与结果

2.1 纯度检查

2.1.1 薄层色谱法 采用薄层色谱法将待标定样品与对照品进行比对[1]，通过主斑点比移值(Rf)、主斑点颜色及深浅、杂质斑点分布等情况可直观快速地对待标定原料纯度进行初步考察，10%硫酸乙醇显色后，可见光及UV 366 nm下检视。结果见图1。由图1可知，两个展开系统下，待标原料与对照品Rf值一致，主斑点明确，未见明显杂质斑点。

注：A.展开剂：异丙醇-冰醋酸-水(9∶4∶3)；B.展开剂：正丁醇-冰醋酸-水(10∶1∶8)上层；S.110815-201308批牛磺胆酸钠对照品(纯度88.9%)。图1 牛磺胆酸钠薄层色谱图

2.1.2 HPLC纯度检查 色谱柱：Agilent SB-C18

(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.4%磷酸二氢钾(68∶32)；流速：1 mL·min-1；检测波长：200 nm；结果见图2。在上述条件下，进样10 μg，样品与溯源保留时间一致；除主峰外，可见杂质峰检出，面积归一化纯度为99.17%；5%自身对照纯度为99.16%。

图2 牛磺胆酸钠原料HPLC图谱

2.1.3 溶剂残留检查 首先采用热重/差热分析(TG/DTA)和气相色谱-质谱(GC/MS)联用系统对牛磺胆酸钠原料中残留溶剂进行筛查，确定含有溶剂种类后进行定量测定。牛磺胆酸钠对照品原料热重曲线可见一明显降落台阶，积分结果显示热重损失为14.9%，结果见图3。气相色谱柱设置温度为230 ℃恒温，热分析仪加热挥散出的气体不经色谱柱分离直接进入质谱测定。TIC模式一级扫描结果见图4。由图3、4比较可知15～30 min时间段，质谱信号响应值呈规律性增大，与热重曲线质量明显改变时间段相符合。对该时间段质谱峰进行分析，结果见图5，由一级质谱信息可看到准分子离子峰46，经与NIST08谱库比对，初步推测牛磺胆酸钠原料中可挥发物质为乙醇。为了进一步证实，本实验将乙醇对照品与供试品同时进行二级质谱测定，CID能量设为20 eV，结果见图6。由图6可知，供试品与对照品乙醇质谱信息基本一致，可检出准分子离子峰m/z：46.1，碎片离子m/z：31.2[CH3CH2OH-CH3]+，m/z：29.2[CH3CH2OH-OH]+，经一级、二级质谱信息可确定牛磺胆酸钠中可挥发性成分为乙醇。在确定牛磺胆酸钠原料含有溶剂种类的基础上，对溶剂残留量进行定量测定，结果含乙醇6.33%(RSD=0.68%)。

图3 牛磺胆酸钠热重曲线图

图4 牛磺胆酸钠可挥发物总离子流图

注：A.牛磺胆酸钠可挥发物质一级质谱图；B.供试品与NIST谱库比对图。图5 牛磺胆酸钠可挥发物质谱比对图

注：A.供试品；B.乙醇对照品。图6 牛磺胆酸钠可挥发物质谱确认图

2.2 结构确认

采用紫外光谱(ultraviolet-visible spectrum，UV)、红外光谱(infrared spectrum，IR)和核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance，NMR)对牛磺胆酸钠原料进行结构确认，牛磺胆酸钠结构图见图7。

图7 牛磺胆酸钠结构示意图

测试方法及条件：UV测定，供试品采用甲醇溶解，浓度约为0.01 mg·mL-1，扫描范围200～400 nm；IR测定采用KBr压片法，供试品与KBr的比例约为1∶200；1H-NMR测定为120 MHz，13C-NMR测定为500 MHz，供试品采用CD3OD溶解。

2.3 定量赋值

牛磺胆酸钠原料定值采用国际上通用的质量平衡法确定含量，同时采用定量NMR技术对质量平衡法赋值准确性进行验证。

2.3.1 质量平衡法赋值结果 质量平衡法的计算公式为：

A=P×(100%-W-R-I)

(1)

式中：A—供试品中牛磺胆酸钠含量(%)P—牛磺胆酸钠原料的色谱纯度(%)W—原料中的水分含量(%)R—原料中残留溶剂含量(%)I—原料中炽灼残渣含量(%)

在牛磺胆酸钠原料的赋值中，原料色谱纯度P为99.16%(见2.1.2)；水分结果W为1.15%(采用库伦滴定法测定7份样品，每份样品约40 mg，RSD=0.38%)，残留溶剂结果R为含乙醇6.33%(RSD=0.68%)，炽灼残渣(《中国药典》2015版一部附录Ⅸ J法)I为3.82%，故采用质量平衡法的赋值结果为99.16%×(1-1.15%-6.33%-3.82%)=87.9%。

2.3.2 定量NMR法验证结果 采用富马酸(日本TCI公司，纯度99.9%)为内标，氘代甲醇溶解待测样品，以牛磺胆酸钠1H谱中的δH2.99(2H，H26)信号峰与内标物1H谱中的δH6.77(2H)信号峰(见图8)，按公式(2)计算供试品的含量，定量NMR法的测定结果为87.9%(RSD=0.52%)。

图8 牛磺胆酸钠定量核磁共振色谱图

(2)

式中：W1—内标物称样量：C1—内标物纯度(99.9%)MW1—内标物分子量(116.07)V1—内标物峰积分面积W2—供试品称样量MW2—供试品分子量(537.68)V2—供试品峰积分面积C2—供试品纯度f—质子比系数

3 结论

本批牛磺胆酸钠原料的结构鉴定结果(UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、MS)与其结构相符合，纯度大于99%(HPLC法和TLC法)，证明该批原料可以用于牛磺胆酸钠的含量测定。

采用质量平衡法测得的牛磺胆酸钠原料含量为87.9%，用定量NMR法测得的结果为87.9%，二者差异较小，说明本批牛磺胆酸钠原料赋值结果准确，该批原料可作为对照品分发，使用。

4 讨论

4.1 TGA/DTA-GC-MS联用系统

TGA/DTA-GC-MS联用系统是一项创新技术，热重分析法(TGA)可分析样品在热作用下质量的变化，缺点是无法确认丢失物，通过气质联用系统来分析热重实验中挥发出来的气体给实验室提供了一种确认方法[2-4]。目前，对照品原料在标定过程中采用TG/DTA-GC-MS联用系统，在测定热重损失的同时，可对挥发性成分进行快速筛查，再经气相色谱法测定溶剂含量，库伦水分仪测定含水量等实验具体给值。

4.2 牛磺胆酸钠炽灼残渣的计算

牛磺胆酸钠原料为牛磺胆酸经成盐处理为其钠盐，牛磺胆酸钠分子量537.68，推算钠含量理论值为4.28%，炽灼残渣实验过程中，加入浓硫酸进行处理，折算硫酸钠含量应为13.21%，炽灼残渣实验结果残渣量为17.89%，扣除理论值后残渣量为3.82%。

4.3 牛磺胆酸钠定量NMR信号峰的选择

定量NMR技术能够以国际基准品为内标直接测定供试品的纯度，具有专属性强、计量溯源性等优势，近年来已被尝试用于对照品的标化中[5-9]。在牛磺胆酸钠原料赋值过程中，采用定量NMR方法对质量平衡法进行验证。定量峰选择上，避免活泼氢干扰，尽量选择信号稳定，杂质峰干扰小的26位的两个氢质子进行定量分析，结果与质量平衡法相互吻合，保证了牛磺胆酸钠定值准确。

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EstablishmentofChemicalReferenceSubstanceofSodiumTaurocholate

WANG Qi，HE Yi，ZHENG Xiaowei，YAO Lingwen，LIU Yan，DAI Zhong*，MA Shuangcheng*

(NationalInstitutesforFoodandDrugControl，Beijing100050，China)

Objective：To establish chemical reference substance (CRS) of sodium taurocholate.Methods：The structure of the candidate material was characterized by ultraviolet-visible (UV)，infrared (IR) and nuclear magnetic resonance (NMR，including1H-NMR and13C-NMR).Its chromatographic purity was determined by thin-layer chromatographic (TLC) systems and high performance liquid chromatography (HPLC).In this study a rapid determination of the volatilizable substance in sodium taurocholate was firstly to use with a TGA/DTA-GC-MS combined system.Results：The results of qualitative identification of sodium taurocholate was 99.16%.The assigned value by mass balance method was 87.9%，in accordance with that obtained by quantitative NMR (87.9%).Conclusion：The structure and purity of the sodium taurocholate material met the requirements of CRS for assay.The accuracy of the assigned value obtained by mass balance method was accurate and reliable.Thus the sodium taurocholate material can be used for quality control.

Sodium Taurocholate；substance calibration；structural characterization；standard material analysis；mass balance method

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.009

2015-12-22)

*

戴忠，研究员，研究方向：药物分析，Tel：(010)67095376，E-mail：daizhong@nifdc.org.cn；马双成，研究员，研究方向：药物分析及药物安全性评价，Tel：(010)67095282，E-mail：mashuangcheng@nifdc.org.cn