丹参鲜药材中丹酚酸B含量测定△

李兵，刘丽，周大铮，李德坤，杨悦武，鞠爱春*

(1.天津天士力之骄药业有限公司，天津 300402； 2.天津市中药注射剂安全性评价企业重点实验室，天津 300402； 3.中国药科大学，江苏 南京 210038)

·基础研究·

丹参鲜药材中丹酚酸B含量测定△

李兵1，2，刘丽3，周大铮1，2，李德坤1，2，杨悦武1，2，鞠爱春1，2*

(1.天津天士力之骄药业有限公司，天津 300402； 2.天津市中药注射剂安全性评价企业重点实验室，天津 300402； 3.中国药科大学，江苏 南京 210038)

目的：建立丹参鲜药材预处理方法并测定鲜药材中丹酚酸B的含量。方法：通过使用不同方式提取丹参鲜药材，比较各提取液图谱差异，对丹参鲜药材提取的方式、溶剂用量等进行考察，并测定6批鲜丹参的丹酚酸B的含量。结果：丹参鲜药材切段后回流提取或在特定溶媒中粉碎可提取出丹酚酸B；确定丹参鲜药材预处理方法为：药材切段，加入25倍甲醇，粉碎，超声30 min。结论：丹参鲜药材中含有丹酚酸B，在提取前不能直接粉碎，否则不能提取出丹酚酸B。

丹参；提取；成分转化；丹酚酸B

丹参为唇形科植物丹参Salviamiltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦之功效[1]。丹参在陕西、四川、山东、河南等多地均有种植。陕西商洛地区气候条件适宜，丹参资源丰富[2]，目前该地区已建立丹参GAP种植基地。丹参药材中水溶性的有效成分丹酚酸类含量较高，丹酚酸具有较强的清除自由基及抗氧化作用，在保护心脑损伤细胞等方面具有明显效果[3]，常用于治疗冠心病、心绞痛、脑梗死、降血脂等[4]。

研究丹参尤其是鲜药材中酚酸类成分，对于研究有效成分的积累及转化、丹参种植、采收期的确定等都具有重要意义。但目前关于丹参新鲜药材中水溶性成分的研究报道较少，且鲜药材中存在很多影响酚酸类物质含量的因素。因此，本实验通过研究比较鲜丹参经过不同的预处理方法的成分变化，建立一套丹参鲜药材中丹酚酸B的含量测定方法，对于研究丹参药材中酚酸类成分、研究丹参饮片加工工艺、研究丹参植株的优选、丹参种植等都具有一定的意义。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

丹参鲜药材，采自陕西省商洛丹参GAP基地，秋季采挖。

丹参提取物由实验室自制，由丹参饮片采取回流提取、纯化等操作制得。提取物中丹酚酸B含量50%以上，总酚酸80%以上。

丹酚酸B(中国食品药品检定研究院，纯度>98%，批号：111562-201313)、迷迭香酸对照品(中国食品药品检定研究院，纯度>98.8%，批号：111871-201001)；紫草酸对照品(天津一方科技有限公司，纯度>98%，批号：10092603)；色谱乙腈(Merck，Germany)；超纯水；其他试剂为分析纯。

1.2 仪器

Waters 2695-2998 高效液相色谱仪；MiLli-Q A10超纯水机；KQ5200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DGG101-1BS电热鼓风干燥箱(天津市天宇实验仪器有限公司)；JJ-2高速组织捣碎机(上海比朗仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 鲜丹参药材提取方法考察

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Dikma Diamonsil C18(2) (250 mm×4.6 mm，5 μm)流动相为乙腈-0.05%磷酸水溶液(22∶78)，等度洗脱，柱温为25 ℃，检测波长为288 nm，流速为0.7 mL·min-1。

对照品溶液(丹酚酸B约0.2 mg·mL-1)及丹参提取物溶液(约1 mg·mL-1)的图谱见图1。

注：1.迷迭香酸；2.紫草酸；3.丹酚酸B；4.未知峰X。图1 对照品(A)和丹参提取物水溶液(B)HPLC图

2.1.2 提取方式的选择 取鲜丹参，切成长度为1 cm左右小段，取10 g，加水100 mL，回流提取30 min。滤过，进样分析。

取鲜丹参，匀浆机粉碎，取10 g，加水100 mL，回流提取30 min。滤过，进样分析。不同状态下的丹参药材回流提取图谱见图2。

图2 不同状态丹参药材回流提取液的HPLC图对比

结果表明鲜药材经过粉碎后提取得到的水溶性酚酸类成分含量甚微，因此选用切段状态的鲜丹参进行提取。由于高温下丹参的主要成分丹酚酸B含量下降较快[5-6]，无法得到准确的药材本身固有信息，因此选择超声提取。

2.1.3 提取溶剂的选择 取鲜丹参，切成1 cm左右小段，称取3份样品各10 g，分别加入100 mL水、甲醇、25%氯化钠溶液，粉碎，超声提取30 min。离心，滤过，进样分析。各提取液图谱见图3。

图3 不同溶剂超声提取丹参段的HPLC图对比

结果表明鲜药材切段后在水中粉碎，提取液图谱中未发现明显的酚酸类色谱峰；鲜药材切段后在甲醇或25%氯化钠溶液中粉碎，提取液中有大量酚酸类物质，说明鲜药材样品中含有丹酚酸，并可以被提取出来。

因此，使用高浓度盐溶液及甲醇溶液均可提取出丹酚酸，选择常用的甲醇作为提取溶剂。

2.1.4 提取溶剂用量的选择 取鲜丹参，切成1 cm左右小段，取4份各25 g，分别加入10倍甲醇，粉碎。加入甲醇使各溶液甲醇加入量分别为10倍、25倍、50倍、100倍，室温下超声提取30 min。补重，离心，滤过，进样分析。

各样品中丹酚酸B含量分别为0.827%、0.898%、0.906%、0.911%。使用25倍甲醇即可满足提取要求。

2.1.5 提取时间选择 取鲜丹参，切成1 cm左右小段，取4份各25 g，分别加入10倍甲醇，粉碎。加入甲醇使溶剂量达到25倍，室温下超声提取5、10、30、60 min。补重，离心，滤过，进样分析。

各样品中丹酚酸B含量分别为0.765%、0.849%、0.901%、0.893%。

加入溶剂后的药材不易被均匀粉碎，药材经粉碎后仍可见纤维状粗粉，过短的时间不足以将目标成分完全提取，30 min可满足提取要求。

2.2 供试品溶液的制备

取丹参鲜药材切成1 cm左右小段，取样25 g，加入10倍甲醇，粉碎。加入甲醇使溶剂量达到25倍，超声提取30 min。离心，滤过，补重即得供试品溶液。

2.3 样品稳定性试验

取鲜丹参，切成1 cm左右小段，取25 g，加入10倍甲醇，粉碎。加入甲醇使溶剂量达到25倍，室温下超声提取30 min。离心，滤过，分别在0、2、4、8、12 h进样分析。结果表明各时间点图谱中丹酚酸B峰面积波动均在2%以内(迷迭香酸、紫草酸色谱峰面积波动在3%以内)，说明供试品溶液在12 h内稳定。

2.4 重现性试验

取鲜丹参，切成1 cm左右小段，取6份各25 g，分别加入10倍甲醇，粉碎。加入甲醇使溶剂量达到25倍，室温下超声提取30 min，补重，离心，滤过，进样分析。

各样品中丹酚酸B含量分别为0.907%、0.902%、0.898%、0.883%、0.911%、0.904%，均值为0.903%，RSD=1.09%。结果表明该方法重现性良好。

2.5 加样回收试验

取鲜丹参，切成1 cm左右小段，取6份各12.5 g，分别加入10倍甲醇，加入丹酚酸B对照品溶液适量，粉碎，加入甲醇使溶剂量达到25倍，室温下超声提取30 min。补重，离心，滤过，进样分析。各样品加样回收率分别为97.6%、98.3%、103.2%、96.8%、100.5%、97.4%。结果表明加样回收率良好。

以上考察说明该方法适用于丹参鲜药材的提取。按本法操作，本批实验用丹参鲜药材中酚酸类成分图谱见图4。

注：1.迷迭香酸；2.紫草酸；3.丹酚酸B。图4 丹参鲜药材酚酸类成分HPLC图

2.6 样品测定

取丹参鲜药材6批，按2.2法制备供试品溶液后进样分析。另分别取各批切段后的药材25 g，加热干燥，计算各自水分。分别以鲜药材及干药材计，计算各批样品中丹酚酸B含量，结果见表1。结果表明丹参鲜药材中存在一定量的丹酚酸B。

表1 丹参鲜药材中丹酚酸B含量测定结果

3 讨论

有研究认为丹参鲜药材中自然存在的酚酸类物质很少，主要是在干燥等过程中胁迫生成[7-9]。本研究认为在丹参鲜药材中含有丹酚酸B，不同的处理方法会得到不同的研究结论。根据2.1.2结果，丹参鲜药材经切段提取与直接粉碎后所得提取液的图谱相差很大，推测鲜丹参经粉碎后会释放一种能够转化丹酚酸类的物质。为进一步证明这个推测，本研究通过以下实验来验证。

3.1 鲜丹参中存在能转化丹酚酸的物质验证实验

丹参提取物加水制得提取物溶液，分成两份。一份加入适量鲜丹参提取液(以实验2.1.3中水提取方式制得的鲜丹参提取液)，另一份加入同量水作空白对照，两份溶液分别进行稳定性考察。结果表明加水稀释的提取物溶液，在12 h内稳定(丹酚酸B峰面积改变小于3%)，但提取物溶液中加入鲜药材提取液后各有效成分峰面积呈下降趋势，说明鲜丹参药材中存在能转化丹酚酸的物质，结果见图5。

注：A.迷迭香酸等3种成分；B.3.丹酚酸B。图5 加入鲜药材提取液的丹参药材中 各成分峰面积变化示意图

3.2 验证实验结果分析

以上实验结果表明丹参鲜药材中含有酚酸类成分，同时存在能将丹酚酸转化的物质。两者可能存在于植物细胞的不同部分，不接触，不会发生反应。药材粉碎后，细胞结构被破坏，鲜丹参水分较高，有利于两者充分接触，反应发生，酚酸类物质被快速转化。因此，粉碎后的丹参鲜药材，不论采取何种方式都不能提取出丹酚酸。

本实验建立了一套丹参鲜药材的预处理方法，且该方法简便快捷，重现性与准确度良好。并明确酚酸类成分为鲜丹参固有成分，同时证明鲜丹参药材中存在一种能够转化丹酚酸的物质。本文仅针对丹参鲜药材进行探讨，其他新鲜的中药材中可能也存在类似情况，本文可为此类研究提供思路，在相关研究中应引起注意。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：76-77..

[2] 蒋传中，卫新荣.丹参种植地点的选择依据及标准研究[J].现代中药研究与实践，2004，18(1)：15-17.

[3] 杜冠华，张均田.丹参水溶性有效成分—丹酚酸研究进展[J].基础医学与临床，2000，20(5)：10-14.

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[5] 张文芯，玄律，倪健.丹酚酸B在水溶液中的稳定性研究[J].北京中医药大学学报，2009，32(12)：856-858.

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[7] Li X B，Wang W，Zhou T S，et al.Production of salvianolic acid B in roots ofSalviamiltiorrhiza(Danshen) during the post-harvest drying process[J].Molecules，2012，17：2388-2407.

[8] 周铜水.丹参的主要活性成分丹酚酸B是采后干燥胁迫诱导的产物[J].中国现代中药，2013，15(3)：211-218.

[9] 冯小艳，周国军，周铜水，等.不同产地丹参药材干燥前后化学成分含量变化[J].安徽医药，2013，17(11)：1863-1866.

DeterminationforSalvianolicacidBfromFreshSalviamiltiorrhiza

LI Bing，LIU Li，ZHOU Dazheng，LI Dekun，YANG Yuewu，JU Aichun*

(1.TianjinTaslyPridePharmaceuticalCo.，Ltd，Tianjin300402，China； 2.TianjinKeyLaboratoryofSafetyEvaluationEnterpriseofTCMInjections，Tianjin300402，China； 3.ChinaPharmaceuticalUniversity，Nanjing210038，China)

Objective：To develop an extraction method of freshSalviamiltiorrhizaand determine the content of salvianolic acid B.Methods：Analyzing the experiment results of Different extraction methods of fresh herbs were analyzed and compared，and the extraction conditions were optimized.Results：Phenolic acids were extracted from fresh herbs cuts by reflux extracted or crushed in particular solvent.Phenolic acids were not extracted ifS.miltiorrhizafresh herbs were mashed directly before the extraction.The extraction conditions was as follows：cutting sections，adding 25 times methanol，ultrasonic crushing 30 minutes.Conclusion：S.miltiorrhizafresh herbs contains salvianolic acid B，and should not be pulverized before extraction.

Salviamiltiorrhiza；extraction；chemical constituents；salvianolic acid B

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.012

2015-12-08)

国家科技重大专项(2012ZX09101202)

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鞠爱春，高级工程师，研究方向：中药注射剂生产与质量管理；Tel：(022) 86342096，E-mail：juach@tasly.com