HS-SPME-GC-MS联用分析不同产地胡芦巴挥发性成分

万丽娟，卢金清，许俊洁，蔡君龙，黎强，郭胜男

(湖北中医药大学 湖北省药用植物研发中心，湖北 武汉 430065)

·基础研究·

HS-SPME-GC-MS联用分析不同产地胡芦巴挥发性成分

万丽娟，卢金清*，许俊洁，蔡君龙，黎强，郭胜男

(湖北中医药大学 湖北省药用植物研发中心，湖北 武汉 430065)

目的：分析比较不同产地胡芦巴挥发性成分的组成。方法：采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(HS-SPME-GC-MS)联用技术，对不同产地胡芦巴中挥发性化学成分进行定性分析，以峰面积归一化法计算各组分的相对含量，并通过主成分分析和聚类分析对数据进行处理。结果：4个产地胡芦巴的总离子流图整体上相似，12个批次的样本在聚类和主成分空间中聚集成为不同的类别，基本实现不同产地胡芦巴的鉴别，不同产地的胡芦巴挥发性成分种类和相对含量有一定的差异，但均含有正己醇、2-甲基-2-烯-1-丁醇、2-甲基-2-丁烯醛、仲丁醇等20种主要成分。另外，样本分布疏密度在一定程度上反映样本的亲缘关系，山西和河北产胡芦巴与四川和安徽产胡芦巴差异较大。结论：本实验方法稳定可靠，适用于胡芦巴挥发性成分的快速分析，并且能反映不同产地胡芦巴挥发性成分含量的差异，为胡芦巴的质量评价提供一定的科学依据。

胡芦巴；挥发性成分；固相微萃取；主成分分析；聚类分析

胡芦巴为豆科植物胡芦巴Trigonellafoenum-graecumL.的干燥成熟种子。胡芦巴味苦，性温，归肾经；具有温肾助阳，祛寒止痛的功能。用于肾阳不足，下元虚冷，小腹冷痛，寒疝腹痛，寒湿脚气[1]。胡芦巴又名芸香草、香草、苦草、苦朵菜、香苜蓿等，为豆科一年生草本植物，成熟时割取全草，打下种子，晒干，生用或微炒用均可。胡芦巴是有名的香草植物，在地中海、欧洲、亚洲、非洲和澳洲均有分布。胡芦巴性耐寒，喜冷凉干旱气候[2]，主产于中国西藏、安徽、四川、宁夏、甘肃等地，其主要有效成分为挥发油[3-6]，具有较强的抗氧化活性和抑菌作用[7-8]。胡芦巴挥发性成分研究报道多采用溶剂法、水蒸气蒸馏法提取挥发油，再通过GC-MS分析，所需样品量大、前处理耗时长，且检测需用有机溶剂稀释，而顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(HS-SPME-GC-MS)联用分析胡芦巴报道较少，且HS-SPME技术无需溶剂、样品量小、重现性好、灵敏度高、操作简单。由于挥发性成分的组成、相对含量与产地的生态环境、亲缘关系和贮存条件关系密切，故本实验采用SPME结合GC/MS联用技术对山西、四川、安徽和河北4个产地12批胡芦巴中挥发性成分进行鉴别，并结合化学计量法进行统计分析，建立快速分析胡芦巴挥发性成分的方法，为不同产地胡芦巴的鉴别提供参考，从而更好地利用胡芦巴的挥发性成分。

1 仪器与试药

1.1 仪器

6890/5973型气相-质谱-计算机联用仪(美国Hewlett-Packard公司)；手动固相微萃取装置(德国IKA公司)；65 μm PDMS/DVB萃取纤维头(美国Supelco公司)；5 mL样品瓶；电子天平(Sartorius，ALC-210.2)。

1.2 试药

实验用原料为山西产胡芦巴(样品编号为1～3)；四川产胡芦巴(样品编号为4～6)；安徽产胡芦巴(样品编号为7～9)；河南产胡芦巴(样品编号为10～12)，由武汉黄鹤楼香精香料有限公司提供，经湖北中医药大学生药教研室鉴定为豆科植物胡芦巴Trigonellafoenum-graecumL.的干燥成熟种子。

2 方法

2.1 固相微萃取条件

实验对萃取头、萃取温度和萃取时间进行了考察，得到了最优萃取条件：取胡芦巴粉末1 g，置于5 mL固相微萃取仪专用顶空瓶中，用带有100 μm PDMS萃取纤维头的手动进样器插入瓶内，80 ℃平衡15 min，再顶空萃取5 min，取出，立即插入色谱仪进样口(温度250 ℃)，解吸3 min。

2.2 GC-MS的分析条件

2.2.1 色谱条件 色谱柱：HP-5MS石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；程序升温：初始温度为30 ℃，保留4 min，以8 ℃·min-1升至70 ℃，再以5 ℃·min-1升至100 ℃，最后以8 ℃·min-1升至200 ℃，保留3 min；进样口温度：250 ℃；载气：氦气；流速：0.8 mL·min-1；进样模式：不分流进样。

2.2.2 质谱条件 离子源：EI源；离子源温度：230 ℃；四级杆温度：150 ℃；电子能量：70 eV；倍增管电压：1.2 kV；接口温度：280 ℃；质量范围：35～550m/z。

2.3 统计学处理方法

利用SPSS软件，采用主成分分析和系统聚类分析两种数据处理方法对实验所得数据进行分析。

3 结果

经化学工作站数据处理及用面积归一化法从各总离子流图(如图1～4)中计算各组分相对百分含量，按各峰的质谱图经 NIST 谱库检索，确定各个组分，初步鉴定了76种化合物。结果表明，不同产地的胡芦巴挥发性成分种类和相对含量有一定量的差异，但均含有正己醇、2-甲基-2-烯-1-丁醇、2-甲基-2-丁烯醛、仲丁醇等20种主要成分，分析结果见表1。以20个共有峰的峰面积作为变量，得到12×20的数据矩阵，使用SPSS19.0软件进行主成分分析和聚类分析。

图1 山西产胡芦巴总离子流图

图2 四川产胡芦巴总离子流图

图3 安徽产胡芦巴总离子流图

图4 河北产胡芦巴总离子流图

序号化合物相对百分含量(%)1234567891011121甲氧基乙醛Methoxy⁃acetaldehyde0761310207209609106303808123⁃甲氧基⁃1，2⁃丙二醇3⁃Methoxy⁃1，2⁃propanediol1681081251123R⁃(⁃)⁃1，2⁃丙二醇R⁃(⁃)⁃1，2⁃Propanediol13623825210802913924833627920323425843⁃羟基⁃2⁃丁酮3⁃Hydroxy⁃2⁃butanone1030781065仲丁醇2⁃Butanol13426715221928939644850561214310913261⁃戊烯⁃3⁃醇1⁃Penten⁃3⁃ol10419814472⁃戊醇2⁃Pentanol0712183，5⁃二甲基呋喃3，5⁃Dimethylfuran11613209513815318692⁃甲氧基乙醇2⁃Methoxyethanal103074121029027018102，3⁃丁二醇2，3⁃Butanediol151186119112⁃甲基⁃2⁃丁烯醛2⁃Methylcrotonaldehyde1821232083064343971051954106314751424152512正戊醇1⁃Pentanol109121084349386343592698563232208212132⁃甲基⁃2⁃烯⁃1⁃丁醇2⁃Methylbut⁃2⁃en⁃1⁃ol33844540616181725156111211861242586554501142⁃甲基⁃3⁃丁烯⁃2⁃醇3⁃Methyl⁃1⁃buten⁃3⁃ol11415己醛Hexanal88892790518413718270466460924528729516正己醇Hexylalcohol4635095742561267825121732068198485265964117甲酸⁃1⁃甲基丙基酯1⁃Methylpropylformicacidester246274257108009012006123107078069092181，1⁃二乙氧基乙烷1，1⁃Diethoxyacetal155084192⁃庚醇2⁃Heptanol09520丙基丙二酸Propylmalonicacid10708500609521乙酸戊酯Amylacetate11911322梨醇酯Prenylacetate103076231⁃辛烯⁃3⁃醇1⁃Octen⁃3⁃ol105113107131065085242⁃戊基呋喃2⁃Amylfuran143067127348313239236242263542451416251，3⁃二甲基环己烷1，3⁃Dimethylcyclohexene1209614126γ⁃己内酯gamma⁃Hexalactone04627己酸Caproicacid10699549728异辛醇2⁃Ethyl⁃1⁃hexanol10829反⁃2⁃辛烯醛(E)⁃2⁃Octenal039058302⁃甲基⁃3⁃乙氧基⁃1，4⁃丁二醇2⁃methyl⁃3⁃ethoxy⁃1，4⁃butanediol12504701409601731(Z)⁃6⁃辛烯⁃2⁃酮(Z)⁃6⁃Octen⁃2⁃one11232邻异丙基甲苯2⁃isopropyltoluene132206275068035289255264333⁃甲基⁃2⁃丁烯酸乙酯Ethyl3⁃methylcrotonate1023119610434右旋萜二烯Glidesafe00307102810304710135γ⁃萜品烯γ⁃Terpinene06709810436双戊烯Ciene05403210637正壬醛1⁃Nonanal1830651273434820223918320463850252438右旋香芹酮D(+)⁃Carvone01600339反式⁃2⁃壬烯醛trans⁃2⁃Nonenal10211409317112913701802603924822528340桉叶油醇Cineole10300101809312911709814812524323929241桃金娘烯醛Benihinal03602800642茴香酮(+)⁃Fenchone04143芳樟醇Linalool06

表1(续)

3.1 主成分分析结果

将二维数据矩阵导入到 SPSS19.0软件进行多变量统计分析。第一主成分(正己醇)的方差贡献率为64.671%，第二主成分(2-甲基-2-烯-1-丁醇)的方差贡献率为19.990%，第三主成分(2-甲基-2-丁烯醛)的方差贡献率为12.932%，前3个主成分的累计方差贡献率为97.593%。图5为12批胡芦巴药材的前3个主成分的空间分布图。从图中可见同一产地的样品在分布上相对集中，不同产地的样品在分布上则有一定差异，山西和河北产胡芦巴与其他两个产地差异较明显，结果表明，采用主成分分析法能够有效地区分山西、四川、安徽和河北的胡芦巴。

图5 12批胡芦巴样品的主成分分析图

3.2 系统聚类分析结果

利用 SPSS19.0 软件，采用Ward’s 聚类法，以Euclidean 距离为测度、峰面积百分率为基准，对4个产地的12批胡芦巴进行聚类分析，得树状图。结果如图6所示，样本层次聚类分析聚成4类，样品1、2、3聚为一类，样品4、5、6聚为一类，样品7、8、9聚为一类，样品10、11、12聚为一类。该图直观地显示了整个聚类过程，缩小了凭借主观判断造成的误差。聚类分析结果表明，不同产地的胡芦巴具有一定的内在差异，同一产地的胡芦巴在化学成分上具有相似性。结果表明山西和河北产胡芦巴与其他两个产地胡芦巴差异较大，可能是生态环境不同所致。

图6 12批胡芦巴样品的聚类分析结果

4 讨论

采用HS-SPME-GC/MS联用技术对安徽、甘肃、河南和河北4个产地共12批胡芦巴进行分析，该方法样品前处理简单，无需有机试剂萃取，样品用量少，快速准确，能较好检测样品的挥发性成分，可用于胡芦巴挥发性成分的研究。4个产地中山西和河北产胡芦巴与其他产地胡芦巴差异较大，分析结果发现山西产胡芦巴的挥发性成分含量最高，种类最多。在同一种植物中，因生长地区与环境的不同，所含挥发油的成分和含量会有显著差别，山西生态环境更适合胡芦巴的生长。

采用主成分分析法和聚类分析法两种数据处理方法对固相微分析所得数据进行处理，样本在主成分空间中聚集成为4个不同的类别，基本实现不同产地胡芦巴的鉴别；聚类分析的树状图能区分不同产地的胡芦巴，反映不同产地胡芦巴间的相似关系，并在一定程度上反映样本间的亲缘关系。采用这两种分析方法对HS-SPME-GC/MS所得数据进行处理可以全面客观地反映不同产地药材间的差异，可以作为一种快速鉴别不同产地胡芦巴的方法。

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AnalysisonVolatileComponentsofSemenTrigonellaefromDifferentHabitatsbyHS-SPME-GC-MS

WAN Lijuan，LU Jinqing*，XU Junjie，CAI Junlong，LI Qiang，GUO Shengnan

(HubeiUniversityofChineseMedicineResearchandDevelopmentCenterofMedicinalPlantinHubeiProvince，Wuhan430065，China)

Objective：To analyze essential components of Semen Trigonellae from different habitats.Methods：The volatile constituents were extracted with HS-SPME and their contents and names were confirmed by GC-MS.The data were handed through principal component analysis and cluster analysis.Results：Total ionic chromatogram of Semen Trigonellae from four areas were similar on the whole，the samples were classified into different categories by clustering and principal component space analysis，by which the origin could be distinguished.All samples contained 20 kinds of components，for example hexyl alcohol，2-methylbut-2-en-1-ol，2-methylcrotonaldehyde and so on.To a certain extent，distribution of sample density reflected the phylogenetic relationship of samples.The samples from Shanxi and Hebei province were different from those from Sichuan and Anhui province.Conclusion：The method is reliable and stable，and can be applied to the analysis of essential components in Semen Trigonellae and to identify Semen Trigonellae of different habitats.It provides scientific basis for quality assessment of Semen Trigonellae.

Semen Trigonellae；volatile constituents；HS-SPME；cluster analysis；principal component analysis

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.010

2015-06-16)

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卢金清，教授，研究方向：中药及其天然药物活性成分；Tel：(027)68890101，E-mail：ljq59169@sohu.com