以细胞筛为载体的玻璃化冷冻和慢速程序化冷冻保存人卵巢组织的效果比较

姬萌霞，孙正怡，郁琦，甄璟然，王雪，刘美芝

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院妇产科，北京　100730)



·实验研究·

以细胞筛为载体的玻璃化冷冻和慢速程序化冷冻保存人卵巢组织的效果比较

姬萌霞，孙正怡*，郁琦*，甄璟然，王雪，刘美芝

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院妇产科，北京100730)

目的比较以细胞筛为载体的玻璃化冷冻与慢速程序化冷冻用于人卵巢组织冷冻的效果。方法人卵巢组织取皮质切块后，随机分为3组：新鲜组织对照组(F组)、慢速程序化冷冻组(S组)及以细胞筛为载体玻璃化冷冻组(V组)。卵巢组织冷冻复苏后，固定切片后行苏木素-伊红染色，观察卵泡形态；使用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术，观察卵泡凋亡情况；部分卵巢组织体外培养，隔日采集培养液后检测雌二醇(E2)浓度。比较三组卵泡正常形态率、卵泡凋亡率及E2浓度。结果与F组原始卵泡正常形态率(91.1%)相比，V组原始卵泡正常形态率(88.1%)无显著差异(P>0.05)，而S组原始卵泡正常形态率(79.6%)显著下降(P<0.001)；V组初级卵泡正常形态率(74.2%)与S组(73.6%)相似，但两组均低于F组(89.0%)(P<0.05)；凋亡检测中，3组凋亡率无显著差异(P>0.05)；体外培养2周，各组E2浓度持续上升，F组E2浓度显著高于S组、V组(P<0.001)，而S组与V组E2浓度无显著差异(P>0.05)。结论以细胞筛为载体的玻璃化冷冻能较好地保存人卵巢组织，复苏后组织体外培养后，还可持续分泌E2。

细胞筛；玻璃化冷冻；慢速冷冻；卵巢冷冻；生育力保存

【Abstract】

Objective：To compare the cryopreservation effect of human ovarian tissue between vitrification with a cell strainer as the carrier and slow freezing procedures.

Methods：Human ovarian tissue was retrieved from 4 women undergone oophorectomy. After processing，the ovarian cortexes were randomly assigned to three groups：fresh group as a control，slow freezing group and vitrification group. The cell strainer was applied as a carrier of vitrification. After thawing，the tissues were fixed for histological examination and apoptosis analysis with TUNEL assay. Besides，part of thawed tissues were cultured in vitro，and estradiol (E2) concentration in the medium was tested. Relative results were compared among the three groups.

Results：The rate of morphologically normal primordial follicles were comparable between the fresh group (91.1%) and vitrification group (88.1%)(P>0.05)，while that of slow freezing group was significantly decreased (79.6%) (P<0.001). Morphologically normal primary follicles were similar between the slow freezing group (73.6%) and vitrification group (74.2%)，but both were significantly lower than that of the fresh group (89.0%)(P<0.05). The apoptosis rate was not significantly different among the three groups (P>0.05). After culturing in vitro for 2 weeks，the concentration of E2continued to rise. E2concentration in the fresh group was significantly higher than that in slow freezing group and vitrification group (P<0.001)，but E2concentration was comparable between slow freezing group and vitrification group (P>0.05).

Conclusions：Vitrification with cell strainers as carriers is effective for human ovarian tissue cryopreservation. After thawed and cultured in vitro，these tissue can secret E2.

(JReprodMed2016，25(9)：821-826)

随着肿瘤诊治的进展，越来越多的女性肿瘤患者可以获得长期生存，但手术、放疗、化疗等治疗都有可能损伤患者的生育功能；一些良性疾病，如系统性红斑狼疮、地中海贫血等疾病在治疗的过程中也可能损伤性腺；Turner综合征、卵巢早衰家族史的女性发生卵巢早衰的风险较大[1]。以上女性客观上都有生育力保存的需求。

卵母细胞冻存、胚胎冻存是生育力保存的经典方法。但这些方法必须超促排卵，在一些进展迅速的肿瘤中有可能延误治疗时机，促排卵药物使用后雌激素浓度异常增高，还可能加速如子宫内膜癌、乳腺癌等激素依赖性肿瘤的进展[2]；另外，胚胎冻存并不适用于没有配偶的女性。对于那些疾病进展迅速、迫切需要放化疗的女性，卵巢组织冷冻可作为生育力保存的又一选择。

慢速程序化冷冻与玻璃化冷冻是卵巢组织冷冻可采取的两种方法，其中又以前者为主[2]。玻璃化冷冻在胚胎和卵母细胞冻存上占据优势，但用于卵巢组织冷冻的效果和安全性还在研究当中。其中，冷冻载体的选择是关系到玻璃化冷冻效果的重要因素[3]。本研究拟采用细胞筛作为冷冻载体，观察卵巢组织玻璃化冷冻的效果。

材料与方法

一、卵巢组织的获取及处理

1.标本来源：年龄在18～38岁行附件切除术的4例女性患者，其中2例为子宫内膜癌，2例为血管平滑肌瘤病。平均年龄(32.8±4.5)岁，2例既往有生育史，2例未育。截取少量卵巢皮质组织作为实验标本；所有患者在试验前签署知情同意书。本研究获得协和医院伦理委员会批准。

2.卵巢组织处理：将手术切除的卵巢组织置于G-MOPS plus溶液(Vitrolife，瑞典)中，室温下带回实验室。于37℃超净台上用尖刀片剔除卵巢血管结缔组织，将卵巢皮质切成(1～2)mm×(2～3)mm×(2～3)mm的组织块。同一病例来源的卵巢组织块随机分新鲜对照组(F组)、慢速程序化冷冻组(S组)及玻璃化冷冻组(V组)；每组卵巢组织块为10块。

二、卵巢组织的冷冻与复苏

冷冻基础液为G-MOPS plus溶液(Vitrolife，瑞典)，其余试剂均购自美国Sigma公司，以G-MOPS plus作为溶媒配制冷冻保护液。所有溶液均通过0.22 μm孔径过滤器(Millipore，法国)除菌后再使用。

1.慢速程序化冷冻方法(S组)：冷冻保护剂为丙二醇(PROH)与蔗糖，载体为冷冻管。冷冻保护液1中含1.5 mol/L PROH，冷冻保护液2含1.5 mol/L PROH与0.1 mol/L 蔗糖。室温下(22℃～25℃)将处理过的组织块转移到冷冻保护液1中充分浸没，5 min后转移至装有1.8 ml冷冻保护液2的冷冻管中，4℃下平衡30 min，最后转到程序化冷冻仪进行程序化冷冻。

程序冷冻仪运行程序如下：①自4℃开始，-2℃/min降到-8℃；②在-8℃维持10 min后进行手工植冰；-8℃维持10 min；③以-0.3℃/min速度降温到-40℃；④以-30℃/min速度降温到-150℃；⑤迅速投入液氮中保存。

2.玻璃化冷冻方法(V组)：冷冻保护剂为二甲亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、蔗糖、聚蔗糖(Ficoll 400)，载体为细胞筛(BD，美国)，孔径100 μm。预平衡液中含7.5%(v/v)DMSO与7.5%(v/v)EG，玻璃化冷冻液中含15%(v/v)DMSO、15%(v/v)EG、5.8 mg/ml Ficoll 400、0.58 mg/ml蔗糖。将卵巢组织块平铺于细胞筛上(图1)，将细胞筛移至预平衡液中，使组织块充分浸没，平衡5 min，再转移至玻璃化冷冻液中平衡5 min，无菌滤纸吸取多余冷冻液后迅速投入液氮，置于液氮罐内保存。

图1　置于冷冻液内的细胞筛

3.复苏方法：S组与V组均使用相同的方法进行复苏。液氮中取出卵巢组织，空气中停留5～10 s后，以冷冻管为载体的S组置于37℃水浴解冻至肉眼所见冰晶溶解，以细胞筛作为载体的V组无需水浴，直接复苏。两组的复苏过程相同，卵巢组织依次投入蔗糖浓度为0.67、0.33、0.20、0 mol/L的复苏液中，充分洗涤，平衡5 min。复苏完成后一部分组织进行体外培养，另一部分用4%多聚甲醛固定，留待组织学分析。

三、卵巢组织的制片、染色及形态学分析

3组卵巢组织经4%多聚甲醛固定后脱水、浸蜡包埋后切片，苏木素-伊红(HE)染色。单盲法观察切片中各卵泡的形态，每10个组织切面分析一次。

卵母细胞完整，细胞核及核仁清晰可见，颗粒细胞排列规则的卵泡定义为形态正常卵泡；卵泡结构不完整或消失，卵母细胞皱缩，核固缩，胞质内可见空泡，颗粒细胞排列紊乱，或许多颗粒细胞出现核固缩的卵泡定义为形态异常卵泡。卵泡分类依据Gougeon标准[4]，因切片中以原始卵泡和初级卵泡为主，故只统计二者卵泡正常形态率。为防止重复计数，仅计数有卵母细胞核的卵泡。

四、卵巢组织凋亡检测

3组卵巢组织石蜡切片每组随机挑选两张进行凋亡检测，检测方法为TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)，具体按TUNEL试剂盒(Roche，瑞士)说明书进行。呈棕黄色的为阳性细胞，卵母细胞阳性或50%以上的颗粒细胞阳性定义为卵泡凋亡。

观察3组卵泡凋亡情况并计算凋亡率。原始卵泡凋亡率为凋亡原始卵泡数与整张切片原始卵泡总数之比，初级卵泡凋亡率为凋亡初级卵泡数与整张切片初级卵泡总数之比。

五、卵巢组织的体外培养

体外培养体系参照既往研究方法[5-7]，部分略有改进。培养器皿为含有嵌入式小室的Transwell-24孔板(Corning，美国)。小室预先用100 μl稀释的matrigel胶(BD，美国)包被，小室外室加入培养液600 μl，小室内加入培养液200 μl。培养液主要成分为α-MEM(Corning，美国)，其中加入50 ml/L 人血清白蛋白(HSA，Sage，美国)、10 ml/L 胰岛素铁硒传递蛋白(ITS，Corning，美国)、0.5 U/ml人绝经期促性腺激素(HMG，丽珠医药)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素(Corning，美国)。

将卵巢组织切成约1 mm×1 mm×1 mm大小的组织粒放入小室中，每组各放置4个小室，每个小室中放置卵巢组织块2粒，置37℃、5%CO2培养箱中培养14 d。隔日吸取外室培养液400 μl，收集后置于-20℃下冻存，同时补充等量新鲜培养液。

培养结束后，将隔天收集的培养液统一进行雌二醇(E2)浓度检测，以新鲜培养液作为空白对照。所用方法为化学免疫发光法，试剂盒由美国Beckman Coulter公司提供，检测按说明书要求进行。

六、统计方法

数据用SPSS 21.0 统计软件处理，3组卵泡正常形态率与凋亡率比较使用χ2检验分析。体外培养E2水平比较使用重复测量的方差分析，各组之间两两比较用LSD方法。P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

一、组织学分析

HE染色切片显示，卵巢组织中卵泡散在分布，以原始卵泡、初级卵泡为主，各组均可见到形态正常及异常的原始卵泡和初级卵泡(图2)。

V组原始卵泡正常形态率接近于F组(88.1% vs.91.1%)，无统计学差异(P>0.05)，两组卵泡正常形态率均显著高于S组(P<0.001)；S组、V组初级卵泡正常形态率均低于F组(P<0.05)，但S组与V组之间无统计学差异(P>0.05)(表1)。

二、卵泡凋亡分析

无论是原始卵泡还是初级卵泡，3组间卵泡凋亡率均无统计学差异(P>0.05)(图3、表2)。

表1　三组卵巢组织形态学分析 [n(%)]

注：与其他两组比较，*P<0.001；与F组相比，#P<0.001，†P<0.02

三、体外培养E2浓度检测

体外培养2周后，E2浓度不断增加(P<0.001)；其中，F组浓度显著高于S组(P=0.002)与V组(P=0.001)，但S组与V组无统计学差异(P>0.05)(图4)。

表2　三组卵巢组织切片凋亡率分析[n(%)]

A：新鲜组形态正常的原始卵泡和初级卵泡(×200)；B：玻璃化冷冻组的原始卵泡和初级卵泡，形态基本正常(×200)；C：慢速冷冻组的原始卵泡和初级卵泡，卵泡膜皱缩，形态异常(箭头处)(×200)；D：冻融后的原始卵泡，卵泡膜皱缩，形态异常(箭头处)(×400)图2　卵巢组织切片形态学(HE染色)

A：新鲜组织中正常的初级卵泡，颗粒细胞和卵母细胞染色阴性(×200)；B：玻璃化冷冻组凋亡的原始卵泡，超过50%的颗粒细胞染色阳性，部分间质细胞染色阳性(×200)；C：慢速冷冻组正常的初级卵泡，卵母细胞核染色阳性，部分间质细胞染色阳性(×200)；D：部分颗粒细胞凋亡(红色箭头处)，但卵母细胞未凋亡(黑色箭头处)的卵泡(×400)图3　卵巢组织切片卵泡凋亡检测(TUNEL 染色)

讨　　论

对于需要保存生育力的患者而言，卵巢组织可以通过腹腔镜等微创手术获取，不受月经周期的限制，不影响肿瘤等原发疾病的后续治疗；复苏移植后除了有望生育，还可能恢复内分泌功能；卵巢组织内储存了大量处于休眠状态的原始卵泡，其中的卵母细胞处于第一次减数分裂时期，比较稳定，没有皮质颗粒和透明带等支持结构，利于冷冻保护剂的渗透，理论上对冻融过程的耐受程度更高。但是，卵巢组织厚度(约1 mm)远大于胚胎和卵母细胞，丰富的结缔组织会阻碍冷冻保护剂的渗透，影响冷冻效果；另外，卵巢组织内细胞种类较多，包括基质细胞、卵泡膜细胞、颗粒细胞、卵母细胞等多种细胞，冷冻保护剂对不同类型细胞的作用各不相同，如何在其间达成平衡，最大限度的保存生育力是一个艰巨的任务。因此，与发展较为成熟的胚胎冻存和卵母细胞冻存相比，卵巢组织冻存仍是研究性质，尚未大规模应用于临床。

卵巢组织冷冻有两种方法：慢速程序化冷冻和玻璃化冷冻。目前卵巢组织冷冻复苏再移植后成功妊娠的报道已有35～40例[8]，均使用慢速程序化冷冻。尽管玻璃化冷冻具有操作简便，无需精密仪器控温、耗时少、冷冻损伤小等特点，在胚胎和卵母细胞冻存上已基本取代了慢速程序化冷冻。但是，在卵巢组织冷冻上，玻璃化冷冻与慢速程序化冷冻孰优孰劣，尚无定论。Tanpradit等[9]比较慢速程序化冷冻和玻璃化冷冻保存猫卵巢组织，发现后者的卵泡正常形态率较低，凋亡率较高，有显著差异(P<0.05)。Keros等[10]比较了人卵巢组织经玻璃化冷冻与慢速程序化冷冻后的切片，发现两组卵泡正常形态率与超微结构物有显著差异(P<0.05)，但前者对于基质的冻存效果更佳。而Herraiz等[11]以牛卵巢组织作为研究对象却发现，与玻璃化冷冻组相比，慢速程序化冷冻组闭锁卵泡比例较高，异体移植后，慢速程序化冷冻组的原始卵泡和次级卵泡密度降低(P<0.05)，提示玻璃化冷冻效果优于慢速程序化冷冻。这些研究结论不一致的原因可能在于影响玻璃化冷冻效果的因素较多，如冷冻载体、冷冻保护剂的选择、卵巢组织的体积差异等。其中，冷冻载体的选择尤为重要。

玻璃化冷冻的原理是将在冷冻保护剂中平衡好的卵巢组织投入液氮中快速降温，达到一种“玻璃化”状态，避免冰晶形成，减少冷冻损伤。实现快速降温的重要步骤之一是冷冻载体的选择。目前采用的载体包括冷冻管、开放式拉长麦管、电镜用铜网、Cryoloop、铝箔槽等[3]。冷冻管管壁较厚，蓄积的冷冻保护液较多，对组织毒性较大，降温速度慢，不利于形成玻璃化状态；开放式拉长麦管管径较小，只能容纳1 mm×1 mm×1 mm左右的组织块，对卵巢组织处理的要求较高；电镜铜网和Cryoloop可使组织与液氮直接接触，蓄积的冷冻液较少，但投入液氮时会在组织周围形成蒸汽隔热层，影响降温速度；铝箔槽内的组织块置入液氮后会卷曲成团，与液氮总接触面积减少，降温速度下降，且每次只能处理一个组织块，操作繁琐，总冷冻时间长。本研究中选用的载体细胞筛是用于细胞培养、杂质过滤、细胞分散的工具，主要材质为聚丙乙烯，孔径为100 μm，可使液氮和冷冻保护剂迅速渗透，底面半径约0.8 cm，一次可放置8～10个卵巢组织块，可保持平铺的状态，并不发生卷曲，投入液氮前用滤纸吸取多余冷冻液，尽可能减少投入液氮后产生的蒸汽，迅速降温形成玻璃化状态。从切片中可见，玻璃化冷冻组原始卵泡正常形态率显著高于慢速冷冻组，接近新鲜组织；初级卵泡形态正常率与慢速冷冻相似，说明玻璃化冷冻可能对原始卵泡的保存效果更好。由上可见，细胞筛作为玻璃化冷冻的载体是可行的，这也是本研究的创新之处。

卵泡凋亡是卵巢组织无时无刻不在发生的过程。女性出生时卵巢组织内的原始卵泡为200万左右，一生中仅有400多个卵泡发育成熟，其余都通过凋亡而闭锁[12]。冷冻过程是否会诱导卵泡凋亡？在这一问题上的研究结果不一致。一些研究认为，与新鲜卵巢组织相比，冻融后的卵巢组织凋亡细胞增多，凋亡率显著增加(P<0.05)[13-14]；但是，也有研究者发现冷冻组织和新鲜组织的凋亡率并无显著差异[5，8]。本研究发现，冷冻组织的凋亡率虽略高于新鲜组织，但未达到统计学差异。由于TUNEL检测细胞凋亡仅是一种半定量方法，冷冻过程究竟是否增加卵泡凋亡仍需定量的方法来测定。

卵巢组织体外培养后仍可继续生长，表现为组织内初级卵泡比例增加，颗粒细胞肥大，培养液中可检测到E2、孕酮(P)。Wotiz等[15]研究认为，除卵泡外，体外培养的基质细胞也可分泌E2。Isachenko等[16]也发现，即使卵巢组织块内没有卵泡，体外培养后的P水平与正常对照组相比无显著差异。这些提示基质细胞可能也具备分泌类固醇激素的功能，在冷冻过程中未受到损伤。多个研究将玻璃化冷冻与慢速程序化冷冻的卵巢组织复苏后体外培养，隔日取培养液检测E2、P水平，均呈持续上升的趋势[5-7]。本研究采用类似的体外培养系统，结果与上述研究一致。可见，经过冷冻后，原始卵泡、初级卵泡、基质细胞等仍保存了一定的内分泌功能，这一切为后续移植奠定了基础。受伦理限制，本研究未能将卵巢组织移植到人体内，未能进一步检测冻融组织的内分泌功能。这也是我们未来研究努力的方向。

总之，本研究创新性地将细胞筛作为载体应用于玻璃化冷冻，通过比较切片中卵泡正常形态率、凋亡率，以及体外培养过程中的E2浓度，发现其冻存效果与慢速程序化冷冻相当。细胞筛用于玻璃化冷冻是切实可行的。

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[编辑：罗宏志]

Cryopreservation effect of cell strainer as a novel carrier of vitrification for human ovarian tissue

JI Meng-xia，SUN Zheng-yi*，YU Qi*，ZHEN Jing-ran，WANG Xue，LIU Mei-zhi

DepartmentofObstetrics&Gynecology，PekingUnionMedicalCollegeHospital，PekingUnionMedicalCollege/ChineseAcademyofMedicalSciences，Beijing100730

Cell strainer；Vitrification；Slow freezing；Ovarian tissue cryopreservation；Fertility preservation

10.3969/j.issn.1004-3845.2016.09.011

2016-03-11；

2016-04-06

2015年度默克雪兰诺中国生殖医学研究基金

姬萌霞，女，山西太原人，博士研究生，生殖内分泌专业.(*

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