外源性17-β雌二醇对养殖中华鲟血液若干生化指标的影响

姚德冬，张晓雁，罗静波，柴　毅

(1.长江大学动物科学学院，湖北荆州　434025；2.北京信沃达海洋科技有限公司(北京海洋馆)，北京　100081)



外源性17-β雌二醇对养殖中华鲟血液若干生化指标的影响

姚德冬1，张晓雁2，罗静波1，柴毅1

(1.长江大学动物科学学院，湖北荆州434025；2.北京信沃达海洋科技有限公司(北京海洋馆)，北京100081)

通过对12尾雌性中华鲟(Acipensersinensis)背部肌肉注射不同浓度(0、0.1、0.2、0.4 mg/kg·BW)17-β雌二醇(estradiol)，并在0、60、120和180 d尾部静脉采血，测定血清中钙(Ca2+)、雌二醇(E2)、睾酮(T)、白蛋白(ALB)、卵黄蛋白原(VTG)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)以及胆碱酯酶(CHE)的含量。结果显示，注射雌二醇后，Ca2+和VTG含量均先上升后下降，E2和ALP含量不断上升，T和CHE则含量不断下降。ALT和ALB含量上下波动。此结果表明，雌二醇对养殖中华鲟卵巢发育具有一定的促进作用，但浓度过高会对其肝脏造成损伤，0.1 mg/kg·BW是较为适宜的浓度。

17‐β雌二醇；中华鲟(Acipensersinensis)；血液；生化指标

外源性雌二醇对鱼类性腺发育有较大影响。在性腺未分化时期，外源性雌二醇刺激能够诱导鱼类性腺分化，使其发育为雌性；在卵黄生成期，雌二醇刺激肝脏合成并分泌卵黄蛋白原，促进卵细胞生长。但是，外源性雌二醇进入鱼体后能干扰其内分泌系统，如血糖、胆固醇降低，抑制鱼体生长，还可能对鱼体的肝、肾等器官造成损伤[1]。

中华鲟(Acipensersinensis)隶属于鲟形目(Acipenseriformes)鲟科(Acipenseridae)鲟属(Acipenser)，是大型溯河洄游产卵鱼类。由于长江涉水工程建设阻隔其洄游路线以及长江水域污染加剧等原因，野生中华鲟数量急剧减少，自然繁殖能力大幅下降，自然种群严重衰退，短时间内种群数量难以恢复[2]。全人工繁殖是物种保护的重要措施之一，但是作为全人工繁殖亲本的子一代养殖中华鲟性腺难以发育到Ⅲ或Ⅳ期，性成熟成为其大规模全人工繁殖的主要障碍[3]。近年来有关中华鲟的研究报道有很多且较为深入[4-6]，但是与性腺发育相关的研究较少[7-9]，还需要进一步研究。

本研究对人工养殖至5龄(性腺发育至Ⅱ期)的中华鲟背部肌肉注射不同浓度的17-β雌二醇，并对其部分血液生化指标进行检测，旨在探索17-β雌二醇对中华鲟性腺发育及肝功能的影响，探寻大型化亲鱼性腺发育诱导技术，为中华鲟全人工繁殖技术提供参考。

1　材料与方法

1.1试验材料

1.2试验设计

在预实验的基础上，将实验鱼分为A(0 mg/kg·BW)、B(0.1 mg/kg·BW)、C(0.2 mg/kg·BW)、D(0.4 mg/kg·BW) 4个组，每组3尾实验鱼。雌二醇先用无水乙醇配制成2 mg/mL 溶液，备用。4组实验鱼分别背部肌肉多点注射不同浓度的17-β雌二醇，每2个月注射一次，共计4次。

1.3试验样本采集及测定

首次注射17-β雌二醇记为0 d，在0、60、120、180 d用5 mL一次性注射器尾部静脉采血4 mL，血样置于4 ℃条件下静置30 min，再于4 000 r/min离心30 min，取上层血清后，放入干冰中保存带回实验室，待测。

本次实验测定的生化指标包括钙(Calcium,Ca2+)、卵黄蛋白原(Vitellogenin,VTG)、雌二醇(Estradiol,E2)、睾酮(Testosterone,T)、白蛋白(Albumin,ALB)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、胆碱酯酶(Cholinesterase,CHE)。其中Ca2+、ALB、 ALT、ALP、CHE用Beckman全自动生化分析仪测定，VTG用酶联免疫吸附法(ELISA)测定，E2和T用化学发光法测定。

1.4数据处理

用Excel和SPSS软件对实验数据进行处理，结果均用平均值±标准差(Mean±SD)表示。同一注射时间不同组血液参数的差异显著性用方差分析(one-way ANOVA)检验，用S-N-K法进行多重比较，显著性水平设为0.05。

基于上述分析，景区为维护自身的文明形象，并为其他游客塑造一个更好的景区体验氛围，需要主动对游客的行为进行管理，具体的管理思路如下：

2　结果

2.1中华鲟血清中Ca2+、VTG、E2和T含量变化

如图1所示，Ca2+、VTG含量先下降后上升，B、C、D 3组血清中Ca2+和VTG含量先上升后下降，在120天达到最大值。第60和120天，B、C、D 3组中血清中Ca2+含量与A组有显著差异，C、D 2组与B组有显著差异，但C组与D组无显著差异；第180天，C、D 2组与A、B 2组有显著差异，C组与D组无显著差异，B组与A组无显著差异。

A组血清中E2含量先下降后上升，B、C、D 3组不断上升，180天达到最大值。第60、120和180天，B、C、D 3组血清中E2含量与A组有显著差异，且B、C、D 3组之间有显著差异。

A组血清中T含量略有下降，B、C、D 3组则持续下降。试验期间B、C、D 3组与A组一直存在显著差异。第60天，D组与B、C 2组有显著性差异，B组与C组无显著差异；第120天，B、C、D 3组之间均存在显著差异；第180天，C组与D组无显著差异，但C、D与B组之间有显著差异。

2.2血清中ALT、ALB、ALP、CHE含量变化

如图2所示，A、B、C、D 4组血清中ALT含量上下波动，变化趋势基本一致。第60天，血清中ALT含量下降，B、C、D 3组与A组有显著差异，且高于A组；第120天和180天，血清ALT含量上升后下降，B组与A组无显著差异，C、D 2组与A、B组有显著差异。

A组血清中ALB含量基本稳定，B组血清中ALB含量先上升后下降，C、D 2组血清中ALB含量先稍稍下降，恢复后再次下降。第60天，B、C、D 3组血清中ALB含量与A组有显著差异，且各组之间有显著差异；第120天B组与A、C、D 3组均有显著差异，A、C、D 3组之间无显著差异；第180天，C、D 2组与A组有显著差异，C组与D组之间无显著差异，B组与A组无显著差异，B组与C、D 2组有显著差异。

图1　注射雌二醇后血清中Ca2+、VTG、E2和T含量变化Fig.1　Variations in serum Ca2+,VTG,E2 and T concentrations in A.sinensisinjected with E2 for 0,60,120 and 180 days 图中有一个字母相同则表示同一时间不同组间无显著性差异(P>0.05)，反之，则有显著性差异(P<0.05)。下同。

A组血清中ALP含量先上升后下降，B、C、D 3组血清中ALP含量不断上升。注射雌二醇后，B、C、D 3组血清中ALP含量与A组有显著差异；第60天和120天， B、C、D 3组之间均有显著性差异；第180天，C组与D组无显著差异，C、D 2组与B组有显著差异。

A组血清中CHE含量先上升后下降，波动幅度较小，B、C、D 3组中血清中CHE含量不断下降。注射雌二醇后，C、D 2组血清中CHE含量与A组出现显著性差异时间(第60天)早于B组(第120天)，C、D 2组与B组有显著差异；第60天和120天，C组与D组有显著差异，第180天，C组与D组无显著差异。

3　讨论

3.1注射雌二醇对中华鲟性腺发育的影响

VTG是含有磷、脂、糖的高分子蛋白，是卵黄蛋白的前体。在雌鱼卵巢的卵黄发生期，除了卵母细胞自身合成卵黄蛋白原外，卵母细胞还大量摄取血液中外源性卵黄蛋白原，促进卵巢发育。因此，血清中VTG含量成为判断雌鱼卵巢发育成熟度的重要指标[11]。血清中Ca2+能够促进卵母细胞的发育和蛋白吸收，在卵黄生成期血清中Ca2+浓度随着卵巢发育时期的变化而变化[12-13]。雄性瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrusvachelli)在注射17-β雌二醇后，血清中Ca2+含量上升，其原因是卵黄蛋白原是钙结合蛋白，合成需要大量的钙[14]。E2是鱼体内重要的雌激素，卵黄生成期，血清中E2含量的增加能够诱导肝脏生成卵黄蛋白原[15]。张涛等[16]对西伯利亚鲟投喂经过雌二醇处理的饲料后，血清中E2含量上升，肝脏中VTG基因被显著表达。本次试验对中华鲟注射17-β雌二醇后，B、C、D 3组前120天血清中E2、VTG、Ca2+含量不断上升，表明雌二醇对其卵巢发育有一定的促进作用。张颖等[17]认为外源性雌二醇破坏鱼体内分泌平衡，使得鱼体血液内E2含量上升，T含量下降。本次试验结果中中华鲟血清E2和T含量变化与之一致，表明外源性雌二醇对鱼体内T生成可能有一定的抑制作用。

图2　注射雌二醇后血清中ALT、ALB、ALP和CHE的含量变化Fig.2　Variations in serum ALT、ALB、ALP and CHE concentrations in A.sinensisinjected with E2 for 0,60,120 and 180 days

3.2注射雌二醇对中华鲟肝脏的影响

ALB和CHE主要在肝脏中合成，血清中ALB和CHE含量的变化能够比较准确地反映肝脏的合成能力，而ALT和和ALP主要存在于肝脏中，当肝细胞受损时，细胞膜通透性增强，血清中ALT和ALP含量上升[18]。本次试验中中华鲟注射17-β雌二醇后，B组血清中ALB含量先上升后下降，C、D 2组血清中ALB含量先下降后恢复，而后急剧下降；B、C、D 3组血清中CHE含量均不断下降，B组下降幅度较小。此结果说明B组中华鲟肝脏的合成功能受雌二醇刺激影响较小，C、D 2组中华鲟肝脏合成功能受到雌二醇刺激后影响较大。在120天后，由于中华鲟体内雌二醇不断积累，严重影响肝脏的合成功能，导致ALB合成受阻，进而导致第180天血清中卵黄蛋白原含量降低。同时，本次试验中，B、C、D 3组血清中ALT含量在一定范围内波动，变化趋势基本一致，但B、C、D 3组血清中ALP含量不断上升。在莫桑比克罗非鱼(Tilapiamossambica)的研究中发现其血清中ALP活性升高可能由于石油污染对肝脏造成了损伤[19]。实验组血清中ALP的含量变化也表明，雌二醇可能对中华鲟肝脏造成一定程度的损伤。

刘涛等[8]研究中依据血清中卵黄蛋白原和卵巢发育所需其他营养物质(蛋白质、胆固醇、甘油三脂等)的含量变化，证实雌二醇能够促进中华鲟卵巢发育，本次试验主要通过卵黄蛋白原和固醇类激素的含量变化来判断雌二醇对中华鲟卵巢发育的影响，虽然判断指标不同，但与刘涛等的研究结果一致。刘涛等试验过程中，中华鲟血清中VTG和ALB含量不断上升，本次试验得出与之不同的结果，主要是因为中华鲟肝脏受损，这可能跟雌二醇刺激方式有关，埋植法与持续注射法相比，雌二醇释放缓慢，鱼类应激反应小，也可能因为实验鱼的年龄有关，不同年龄阶段实验鱼的抗应激能力不同，刘涛等研究中所用11龄实验鱼比本次试验中5龄实验鱼的抗应激能力要强，具体原因有待进一步研究。本次试验设立了不同的雌二醇刺激浓度，将卵巢发育指标与肝脏部分功能指标结合，筛选出外源性雌二醇对中华鲟适宜的注射浓度，对完善中华鲟的全人工繁殖技术和物种保护具有参考意义。

3.3雌二醇的适宜注射浓度

本次试验结果表明，外源性17-β雌二醇对养殖中华鲟卵巢发育具有一定的促进作用，但是会对其肝脏造成损伤。因此，在尽可能不影响中华鲟健康的条件下，0.1 mg/kg·BW是17-β雌二醇较为适宜的注射浓度。Zhang等[20]在试验中发现0.5 mg/kg·BW的雌二醇注射浓度使得中华鲟血液红细胞数量和血红蛋白含量均减少，对中华鲟健康产生较大影响，0.1 mg/kg·BW是较为适宜的注射浓度。本次试验17-β雌二醇适宜注射浓度与之一致。

本次试验由于实验材料珍贵且难以取得，所以实验样本较少。今后可以参考本次试验结果，加大检测样本数量进行进一步研究。

[1]Flynn S R,Benfy T J.Effects of dietary estradio-17β in juvenile shortnose sturgeon,AcipenserbrevirostrumLesueur [J].Aquaculture,2007,270:405-412．

[2]刘鉴毅,危起伟,陈细华,等.葛洲坝下中华鲟繁殖生物学特性及其人工繁殖效果[J].应用生态学报,2007,18(6):1397-1402．

[3]危起伟,李罗新,杜浩,等.中华鲟全人工繁殖技术研究[J].中国水产科学,2013,20(1):1-11．

[4]吴湘香,陈细华,危起伟,等.中华鲟早期发育中17β-雌二醇和睾酮水平变化的初步观察[J].淡水渔业,2007,37(2):3-7．

[5]柴毅,龚进玲,危起伟,等.中华鲟子一代配子质量及其子二代生长特征分析[J].水产学报,2014,38(3):351-355．

[6]张晓雁,杜浩,危起伟,等.养殖中华鲟的产后康复[J].水生生物学报,2015,39(4):705-713．

[7]陈细华,危起伟,杨德国,等.养殖中华鲟性腺发生与分化的组织学研究[J].水产学报,2004,28(6):634-639．

[8]刘涛,陈细华,李创举,等.埋植雌二醇对养殖中华鲟雌性幼鱼血清生理指标的影响[J].动物学杂志,2012,47(4):82-88．

[9]张艳珍,陈细华,危起伟,等.中华鲟血清卵黄蛋白原的初步观察[J].淡水渔业,2008,38(5):10-14．

[10]陈细华,危起伟,杨德国,等.低龄中华鲟外科手术性别鉴定技术[J].中国水产科学,2004,11(4):371-374．

[11]田海峰,孟彦,肖汉兵.水生动物卵黄蛋白原研究进展[J].南方水产科学,2014,10(4):91-96．

[12]李朝军,王浩,邓戎,等.大阪鲫卵黄蛋白原和钙离子关系的初步研究[J].水产学报,1993,17(4):297-303．

[13]齐茜,曲秋芝,张颖,等.小体鲟血清卵黄蛋白原和Ca2+浓度与卵巢发育的关系[J].中国水产科学,2009，16(6):967-974．

[14]李云,朱志强,叶勤,等.17-β雌二醇对雄性瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrusvachelli)的雌激素效应[J].海洋与湖沼,2009,40(2):195-200．

[15]林浩然.鱼类生理学[M].广州:广东高等教育出版社,1999．

[16]张涛,田美平,章龙珍,等.17β-雌二醇对西伯利亚鲟幼鱼的雌激素效应[J].生态毒理学报,2011,6(4):415-421．

[17]张颖,孙大江,曲秋芝,等.不同温度下雌激素对施氏鲟早期性腺发育及血清性激素的影响[J].东北农业大学学报,2011,42(12):119-124．

[18]周新,符伟灵.临床生物化学与检验[M].北京:人民卫生出版社,2007．

[19]张勤,徐韧,王桂兰,等.石油污染对莫桑比克罗非鱼血清酶活性的影响[J].海洋学报,1998,20(4):60-64．

[20]Zhang X Y,Chai Y,Wei Q W,et al.Hematological and biochemical responses of juvenile Chinese sturgeon,AcipensersinensisGray 1835,to exogenous 17β-estradiol[J].J Appl Ichthyol,2014,30(6):1216-1221．

(责任编辑：张潇峮)

Effects of exogenous 17-β estradiol on blood biochemical indexes of cultured Acipenser sinensis

YAO De-dong1,ZHANG Xiao-yan2,LUO Jing-bo1,CHAI Yi1

(1.CollegeofAnimalScience,YangtzeUniversity,Jingzhou434025,Hubei,China;2.BeijingXinwodaMarineTechnologyCo.Ltd(BeijingAquarium),Beijing100081,China)

In this study,12 femaleAcipensersinensiswere injected of 17-β estradiol (0,0.1,0.2 and 0.4 mg/kg·BW) in back muscle and blood was collected from the fish tail at 0,60,120 and 180 days.The contents of serum calcium (Ca2+),estradiol (E2),testosterone (T),albumin (ALB),vitellogenin (VTG),alanine aminotransferase (ALT),alkaline phosphatase (ALP) and cholinesterase(CHE) were examined at 0,60,120 and 180 days respectively.Results showed that the concentrations of both Ca2+and VTG increased firstly and then decreased.Both E2and ALP increased continuously,while both T and CHE decreased.The changes of concentrations of both ALT and ALB were fluctuant.Results implied that E2could promote the ovaries of cultured Chinese sturgeon,while high concentrations could result in injury to the liver.

17-β estradiol;Acipensersinensis;blood ；biochemistry indices

2015-11-17；

2016-05-17

香港海洋馆保育基金项目(4040000027)。

姚德冬(1989-)，男，硕士研究生，专业方向为鱼类生理学。E-mail:yaodong369@126.com

柴毅(1978-)。E-mail:chaiyi123456@126.com

S917.4

A

1000-6907-(2016)05-0014-05