NET基因甲基化与职业紧张性高血压的关联性研究

李　榕， 高晓燕， 刘　波， 熊　菲， 刘继文

(新疆医科大学1公共卫生学院， 2第五附属医院， 乌鲁木齐　830011)



NET基因甲基化与职业紧张性高血压的关联性研究

李榕1， 高晓燕1， 刘波1， 熊菲2， 刘继文1

(新疆医科大学1公共卫生学院，2第五附属医院， 乌鲁木齐830011)

目的比较不同职业紧张程度和血压水平下去甲肾上腺素转运体(NET)基因启动子区域DNA甲基化水平，探讨表现遗传学在职业紧张与高血压相关性中的作用。方法采用亚硫酸氢盐克隆测序法处理基因组DNA，随后设计BSP引物进行PCR，并对PCR产物进行测序，判断CpG位点是否发生甲基化。结果各组间NET基因启动子区CpG1 及CpG7的DNA甲基化水平差异有统计学意义(P<0.05)。经LSD两两比较，对照组-高职业紧张组、高血压-高职业紧张组甲基化水平高于高血压-低职业紧张组，差异有统计学意义(P<0.05)。其他不同组合组间的CpG位点差异均无统计学意义。 结论职业紧张组中高血压医务人员其NET基因启动子区CpG1及CpG7位点DNA甲基化水平与对照组不同，提示表观遗传学在职业紧张与高血压之间起一定的调控作用。

职业紧张； 高血压； 甲基化

随着人们生活水平的不断提高，对于职业精神应激的关注度越来越高。同时，职业精神应激所导致的原发性高血压(EH)及其遗传发病机制方面的研究也取得了很大的进展。目前普遍认为高血压是一种复杂性的疾病，环境和遗传因素共同影响高血压的发生和发展[1]。表观遗传学是指在基因碱基序列发生改变的情况下，由于环境和遗传因素相互作用，从而导致基因功能产生了某些可遗传或可逆的变化。目前，DNA甲基化是一个研究热点。

流行病学调查和临床研究发现，在遗传素质相同的职业人群中，职业精神应激不同，则 EH 的患病率也不同。流行病学调查发现，职业应激与EH之间存在显著关联性[2-4]。但亦有研究发现，高紧张状态的职业人群不会都发生高血压，同时两者之间呈现时间和程度上的依赖性[5-10]。

此外，遗传因素或者相关基因也影响着高血压的发生和发展。有研究表明去甲肾上腺素转运体(NET)基因与心血管疾病的发生有关，去甲肾上腺素转运体是将突触间隙的去甲肾上腺素重摄取到突触前神经末梢的可溶性载体蛋白，其编码基因NET位于染色体16q12.2[11]。Markus等[12]研究表明，高血压患者NET基因启动子区DNA甲基化水平明显高于健康受试者，且伴随着结合于该区域的CpG结合蛋白含量增加，甲肾上腺素(NE)再摄取减少，从而使细胞外NE水平升高、交感神经兴奋性增加。这可能是与甲基化介导的基因沉默导致NET功能出现异常有关。而Keller等[13]通过动物实验也发现小鼠经NET基因敲除后，会表现出心动过速和血压升高的现象。本研究拟通过比较不同职业紧张程度和血压水平下NET基因启动子区DNA甲基化水平的差异，初步探讨表观遗传学在职业紧张与高血压相关性中的作用。

1　资料与方法

1.1研究对象按照职业紧张程度及高血压危险因素分层，其中以确诊为高血压的20例患者作为本次研究的病例组，并从调查人群中选取同性别、年龄相差3岁、同民族的医务人员20名作为对照组进行病例对照研究，最终共纳入40名研究对象。按照职业紧张程度高低和有无高血压分为高血压-低职业紧张组、高血压-高职业紧张组、对照组-低职业紧张组、对照组-高职业紧张组4组，每组10例。所有研究对象均为自愿参加本次研究，并签署知情同意书，本研究承诺对研究对象的个人信息严格保密。

1.2纳入及排除标准病例组：根据2012年高血压防治指南规定的诊断标准选取病例组研究对象，包括：(1)未使用降压药物者，不在同一天，且3次坐位测量的血压值为收缩压≥140 mmHg和(或)舒张压≥90 mmHg者；(2)既往有高血压史，虽正服降压药，且血压<140/90 mmHg者，仍诊断为高血压。排除有继发性高血压、严重肾病、肝功能障碍、瓣膜性心脏病、心肌病患者；6个月内发生过不稳定性心绞痛者；孕妇及哺乳期妇女；酗酒者、滥用药物或精神疾病史者。对照组：无高血压降压药物治疗史，无继发性高血压、糖尿病、其他心血管疾病、肝肾疾病史等，无慢性疾病者。

1.3方法

1.3.1血压测量测量前，嘱被调查者静坐10 min，由体检中心医务人员采用汞柱式血压计对其进行血压测量。测量时，研究对象行坐位，肘部和心脏同一水平，测量右上臂血压3次，若血压≥140/90 mmHg，让其静坐休息15 min后再次测量2次，取平均值。

1.3.2一般资料主要包括研究对象的一般人口学特征资料和生活行为习惯资料的收集。一般人口学特征资料包括：年龄、性别、体质指数(body mass index，BMI)；生活行为习惯资料包括：吸烟、饮酒及运动量。职业紧张分组：主要是根据工作紧张测量问卷(JSS)中的工作紧张指数得分对职业紧张程度进行分组，采用四分位节点法将其划分为低职业紧张组、中职业紧张组、高职业紧张组。

1.3.3血样采集研究对象在采血前3天禁止高盐高脂饮食，采血当日早晨禁食，于8∶00到9∶30间静脉穿刺采血5 mL于EDTA抗凝管，并-80℃保存待测。体格检查及信息采集均在上午完成。

1.3.4目标序列确定通过检索UCSC数据库对NET基因启动子区甲基化位点进行确定。并经PubMed、CpG Island Searcher检索后发现NET基因启动子区的CpG岛主要集中于-501～+1 175 bp(NCBI序列登录号AF061198和NC_000016)之间，并且以往研究主要集中于-872～-514 bp、-515～-215 bp和-180～+167 bp这3个区域的DNA甲基化研究。同时，研究发现-180～+167 bp区域的甲基化程度极低，-872～-514 bp区域处于CpG岛边缘，检测难度较大，因此选择-515～-215 bp区域进行DNA甲基化分析。引物设计见表1。

1.3.5NET基因启动子区DNA甲基化水平测定目前最常用的DNA甲基化测定手段有MSP(methylation specific, PCR)和DNA测序等。本研究采用的是焦磷酸测序技术，它是基于DNA序列分析技术，是4种酶催化同一反应体系中的酶级联化学反应，焦磷酸基团最终转化成的可见光信号，并转化为峰值，通过仪器检测DNA甲基化位点的峰值比值来确定甲基化水平[8]。

1.4质量控制实验室质量控制严格遵守分子生物学实验室的操作规则和流程。实验过程中所使用的一次性枪头、EP管、PCR管及容器等均在使用前进行高压灭菌，避免污染。所有试剂、样品加样前均进行离心、吹打混匀后使用，在使用前，保证所有溶液都达到室温。在焦磷酸测序反应中，在查阅文献的基础上，反复预试验后，摸索最适宜的扩增条件进行后续实验。而PCR未扩增出条带的样品，重新进行PCR，合格后进行下一步焦磷酸测序反应的实验。

表1　引物设计

2　结果

2.1均衡性分析高血压发病年龄病例组与对照组在不同年龄组、性别、民族在的分布上均无统计学差异(P>0.05)，病例组与对照组组间均衡可比,见表2。

表2　均衡性分析/例

2.2亚硫酸氢钠修饰电泳结果随机抽取8个样，取PM134-1和PM134-2 PCR产物各5 μL ，分别进行1%琼脂糖电泳，150 V、100 mA 电泳20 min后观察。见图1和图2。

2.3焦磷酸测序方法(Pyrophosphate sequencing method，PM)-测序样品结果图3中的4个峰高从左至右分别代表CpG1、CpG2、CpG3、CpG4，其甲基化程度分别为61%、62%、34%、19%；图4中的5个峰高从左至右分别代表CpG5、CpG6、CpG7、CpG8、CpG9，其甲基化程度分别为4%、2%、11%、3%、9%。

2.4NET基因DNA甲基化位点分析各组CpG1和CpG7差异有统计学意义(P<0.05)，且高血压-高职业紧张组、对照组-高职业紧张组甲基化水平明显高于高血压-低职业紧张组，差异有统计学意义(P<0.05)。但不同组间其余CpG位点比较，差异均无统计学意义(P>0.05),见表3。

高血压组低职业紧张组高职业紧张组对照组低职业紧张组高职业紧张组F/HPCpG148.07±14.6555.24±8.23a50.20±5.1756.18±5.86b3.2970.031CpG253.73±13.4458.05±8.2355.08±8.2262.55±5.971.7370.177CpG335.28±18.5432.36±9.6732.22±4.2732.69±3.580.1770.911CpG418.72±4.5718.98±7.9419.42±2.2819.05±2.820.0340.991CpG56.01±4.078.83±3.516.84±1.988.36±2.331.8080.165CpG65.54±2.105.94±3.575.43±1.856.46±1.630.3740.772CpG711.51±2.5615.99±5.36a12.69±0.9213.00±1.75a3.7120.021CpG82.69±1.423.46±1.043.10±0.843.48±0.801.2450.308CpG99.49±3.0611.93±4.809.81±1.559.9±2.131.2650.301

注：与高血压-低职业紧张组相比，aP<0.05。

3　讨论

目前，高血压是最常见的心血管疾病，高血压为血流动力学异常疾病，是一种与脂肪、糖代谢紊乱共存的代谢病，全世界高血压患病率为22%～27%，其发展易导致心、脑、肾等脏器的损失[14-15]。高血压是造成社会人群发病率和死亡率上升的主要因素，同时还可诱发冠心病和脑卒中等疾病的发生，因此已成为一项重大的公共卫生问题[16]。预计到2025年其流行会增加到60%，将有15.6亿人口可能会患有高血压[17]。过去传统流行病学研究发现，血压和许多因素都有关联，如肥胖、年龄、性别、婚姻状况、婚姻生活的质量、吸烟和被动吸烟、工作场所的噪声、工作负荷、饮食和体育锻炼、轮班工作及紧张都可引起血压的升高[18-21]。

为了更深入了解基因对高血压的影响，更多的学者开始利用表观遗传学的研究方法进行深入的研究。表观遗传现象与遗传DNA序列不同，其可与环境、营养因素的相互作用发生逆转[22]，这使人们在研究复杂多因素疾病(如心血管疾病)的预防治疗方法时面临着更大的挑战。目前虽无学者对职业紧张和高血压表观遗传学变化进行直接研究，但Bayles等[23]研究发现表观遗传学在高血压与惊恐障碍中发挥着相似作用，而惊恐障碍与职业紧张存在相似性。因此，本研究拟通过表观遗传学相关理论，假设NET基因启动子区的DNA甲基化可能也在职业紧张与高血压相关性中发挥调控作用，然后通过比较不同紧张程度和血压水平状态下NET基因启动子区DNA甲基化的差异，从而探讨表观遗传学在职业紧张与高血压相关性中的所起的作用。

Bayles等[23]以体位性心动过速综合征患者为试验组，以正常人作为对照组，同样对两组人群外周血淋巴细胞中NET基因启动子区的DNA甲基化、组蛋白甲基化和乙酰化水平进行分析后发现，随着NET表达水平的下降，试验组患者组蛋白H3的赖氨酸-9、赖氨酸-27等三甲基化基因抑制标志及MeCP2在NET基因启动子区明显富集，而赖氨酸-9/14乙酰化和赖氨酸-4三甲基化等基因激活标志则明显降低。但对两组NET基因启动子区DNA甲基化水平进行比较，差异却无统计学意义。因此，该研究表明组蛋白的修饰作用可能是调控NET基因表达的主要表观调控机制。NET基因的启动子区包含多个潜在的顺式作用元件，如TATA盒，Sp1结合位点(GC盒)、E盒等[24]，可能发挥着转录增强子或维持正常剪接的作用。该区富含CpG二核苷酸，使其容易受到甲基化所致的基因沉默的影响。故NET基因启动子区的DNA甲基化是否与高血压的发生有关。因此，本研究采用焦磷酸盐测序法分析了不同职业紧张程度及血压水平的组合下，外周血白细胞中NET基因启动子区DNA甲基化在各组间的差异，结果显示：各组CpG1和CpG7差异有统计学意义(P<0.05)。其中，对照组-高职业紧张组、高血压-高职业紧张组甲基化水平高于高血压-低职业紧张组，差异有统计学意义(P<0.05)，但其他不同组合组间的CpG位点的甲基化程度比较差异均无统计学意义(P>0.05)。提示NET基因启动子区的DNA甲基化可能在职业紧张性高血压中发挥着某种作用。但由于本次试验的样本量太少，且9个CpG位点中只有2个在不同组间的甲基化程度是有差异的，而其他位点均未显示甲基化异常，因此后续需要进一步增加样本量进一步研究和验证。

已有的研究表明，人类基因组有0.16%左右的SNP位点与其甲基化变化有关[25]，而这种因DNA序列发生改变所致的甲基化改变，可以通过遗传学研究发现。越来越多的研究也表明，有些DNA等位基因或其单体型可能与某些特定的表观遗传学变化有关。因此，在研究疾病的发生、发展过程时，应该进行多方面的考虑，并可以从表观遗传学角度入手，通过基因甲基化、蛋白组学等对其发病机制进行深入研究。

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(本文编辑张巧莲)

The regulation of the methylation of DNA on the promoter of NET gene in occupational stress and hypertension

LI Rong1, GAO Xiaoyan1, LIU Bo1, XIONG Fei2, LIU Jiwen1

(1CollegeofPublicHealth,XinjiangMedicalUniversity;2TheFifthAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

ObjectiveTo explore the regulation of epigenetics in occupational stress and hypertension by comparing the methylation of DNA on the promoter of NET gene under different levels of tense and blood pressure. MethodsDNA was processed by bisulfite-treated genomic clone sequencing andfollowed by PCR with designed BSP primers, then PCR products were sequenced to determine whether CpG sites were methylated. ResultsThe DNA methylation of CpG1 and CpG7 between groups were analysed,and the differences were statistically significant (P<0.05). After LSD pairwise comparison, the control group-group of high occupational stress, hypertension-high occupational stress group methylation level was higher than the hypertension-low occupational stress group, and the difference was statistically significant (P<0.05). The DNA methylation on the other CpG sites were not statistically significant. ConclusionCompared the hypertension group and the control group with occupational stress, there was significant difference in the DNA methylation of GpG1 and GpG7 sites which located in the promoter region of NET gene, suggesting that epigenetic play a regulatory role in the correlation between occupational stress and hypertension.

occupational stress; hypertension; methylation

新疆医科大学2013年科研创新基金(XJC201325)

李榕(1982-)，女，硕士，讲师，研究方向：职业紧张与健康。

刘继文，女，博士，教授，博士生导师，E-mail：liujiwendr@163.com。

R135

A

1009-5551(2016)09-1187-06

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.09.028

2016-04-28]