MAWBP在急性溃疡性结肠炎模型中的作用

陈声波　刘逸　智发朝　赵芯梅

·论著·

MAWBP在急性溃疡性结肠炎模型中的作用

陈声波刘逸智发朝赵芯梅

目的探讨MAWBP在溃疡性结肠炎急性模型中的作用。方法40只BALB/c小鼠随机分成4组，每组10只，分别为正常对照组、Mock组、MAWBP组和MAWD组；Mock、MAWBP和MAWD组饮用4%DSS制作急性溃疡性结肠炎模型，正常对照组饮用高压过的饮用水。造模第1天，正常对照组、Mock组、MAWBP组和MAWD组分别注射慢病毒稀释液、慢病毒空载体、含MAWBP基因慢病毒液、含MAWD基因慢病毒液。造模期间进行疾病活动指数评分；造模结束检测各组小鼠肠道MAWBP蛋白和mRNA表达水平，病理切片评估肠道炎症程度。结果与正常小鼠相比，急性溃疡性结肠炎模型小鼠MAWBP蛋白表达水平明显降低；与Mock组相比，MAWBP组MAWBP蛋白和mRNA表达水平明显升高；MAWBP组小鼠疾病活动指数评分和低于Mock组；病理切片显示MAWBP组肠道炎症水平低于Mock组。结论MAWBP对溃疡性结肠炎急性模型具有保护作用，可通过上调MAWBP表达改善溃疡性结肠炎病情。

MAWBP；溃疡性结肠炎；动物模型

【Abstract】Object To study the effect of MAWBP on acute colitis model in mice.Methods Forty BALB/c mice were assigned randomly into four groups（Normal Control，Mock，MAWBP and MAWD group）with 10 mice per group.Mock，MAWBP and MAWD group drank 4%DSS solution while Normal Control group received autoclaved drinking water.On the first day of the model，Normal Control，Mock，MAWBP and MAWD group received lentivirus diluents，lentivirus vector，lentivirus with MAWBP gene and lentivirus with MAWD gene respectively.Meanwhile，Disease Activity Index was evaluated.At the end of the model，the protein and mRNA expression of MAWBP were detected and histological colitis severity were determined in colonic tissue.Results Mice with acute colitis had a lower protein expression of MAWBP than healthy mice. Mice in MAWBP group had a higher protein and mRNA expression of MAWBP than mice in Mock group. Mice in MAWBP group had a lower score of Disease Activity Index than mice in Mock group.Mice in MAWBP group developed a less severe inflammation than mice in Mock group.Conclusion MAWBP has a protective effect on acute colitis model in mice and up-regulation of MAWBP alleviates ulcerative colitis.

【Key word】MAWBP；Ulcerative colitis；Animal model

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一类原因不明，以肠道慢性非特异性炎症为特征的肠道疾病，主要包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn′s disease，CD）两个类型。病因不明，多与环境、遗传、感染、免疫等因素有关。UC被认为是一类具有高度癌变风险的非可控性炎症［1］，病程长，病变程度轻重不一，临床上常表现反复发作而治愈难度大。因此，寻找更加有效的治疗靶点有利于改变现有的治疗困境。我们前期研究发现，相对于正常人，MAWBP在UC患者肠黏膜中低表达，且与病情严重程度呈负相关［2］。因此，我们推想，能否通过上调肠道组织MAWBP表达水平以缓解UC病情。

材料和方法

一、对象和试剂

1.实验动物

实验动物为由广东省实验动物中心提供的4～6周龄BALB/c雄性小鼠，体重17～21g，饲养在SPF环境内［许可证号：SYXK（粤）2011-0074］。

2.试剂和材料

葡聚糖硫酸钠（dextra sulfate sodium，DSS，MW．40000）购自MP Bio。慢病毒稀释液（细胞培养基DMEM）购自SIGMA-ALDRICH。Western blot所需一抗：GAPDH（美国Abcam）、Actin（美国SIGMA）、MAWBP（美国CST）和MAWD（美国CST）。辣根过氧化物酶标记二抗购自北京中杉金桥。慢病毒表达载体委托赛业生物科技有限公司设计构建。表达载体1：pLV［Exp］-Puro-CMV＞hPbld1［ORF032447］：IRES：EGFP；表达载体2：V［Exp］-Puro-CMV＞hStrap ［NM_011499.3］：IRES：EGFP；对照组载体：pLV［Exp］-Puro-CMV＞EGFP。RT-qPCR所需引物委托英潍捷基公司合成，相关引物如表1所示。

表1　引物序列表

二、实验方法

1.急性溃疡性结肠炎模型制作

将40只BALB/c小鼠饲养在SPF环境，随机分为4组，分别为Normal Control、Mock、MAWBP 和MAWD组，每组10只。除Normal Control组外，其他三组均通过自由饮用4%DSS溶液7天制作溃疡性结肠炎急性模型［3］。造模期间，于第3、5天换入新的DSS溶液。DSS浓度可根据小鼠状态在3%～5%调整。

2.慢病毒转染

于造模第1天分别向Normal Control、Mock、MAWBP和MAWD组腹腔注射等体积（100 μL）慢病毒稀释液、病毒空载体溶液、含MAWBP基因慢病毒溶液和含MAWD基因慢病毒溶液。造模结束（第8天）处死小鼠，取结直肠组织分析MAWBP和MAWD蛋白和mRNA表达情况以验证慢病毒在小鼠肠道组织转染情况。

3.肠道临床严重程度评估

造模期间，进行各组小鼠疾病活动指数评分（Disease Activity Index，DAI）［4-5］，测量小鼠体重，检查肛周，记录排便情况，根据DAI量表（表2）计算评分。

表2　DAI评分表

4.组织病理切片

溃疡性结肠炎急性模型结束处死小鼠，取结直肠组织，进行组织病理切片和HE染色，显微镜下评估各组肠道炎症情况。

三、统计学方法

运用IBM SPSS Statistics 19.0对所有数据进行处理，运用ANOVA方差分析法比较各组RT-PCR结果以及DAI之间的差异，组间两两比较运用LSD方法，P＜0.05被认为差异有统计学意义。

结果

一、急性溃疡性结肠炎模型构建成功

正常对照组小鼠肛周毛发整洁，无稀便、血便粘附，肛门黏膜呈粉红色，无充血、破溃。急性溃疡性结肠炎模型小鼠饮用DSS溶液后1周内全部出现不同程度的进食及进饮减少、体重下降，腹泻、血便，肛周毛发凌乱，肛口稀血便粘附（图1A），提示DSS诱导了小鼠肠道发生急性损伤。造模结束后，小鼠结直肠组织HE染色显示：正常对照组黏膜基本正常，层次结构清晰，腺体排列有序；DSS组黏膜受损，腺体减少、排列紊乱，淋巴细胞增多（图1B）。说明DSS组肠道产生了炎症，提示DSS相关急性溃疡性结肠炎模型构建成功。

二、MAWBP在急性溃疡性结肠炎模型小鼠中低表达

急性溃疡性结肠炎模型结束后，处死小鼠，取结直肠组织进行Western blot分析，发现MAWBP表达在DSS组显著较正常对照组低（图1C），提示MAWBP与肠炎活动程度呈负相关，结合我们之前研究［2］，MAWBP在溃疡性结肠炎中可能发挥保护作用。

三、上调MAWBP表达可降低急性溃疡性结肠炎模型小鼠的疾病严重程度

造模期间，腹腔注射含目标基因的慢病毒颗粒使MAWBP在肠道组织过表达，造模结束取结直肠组织，Western blot检测MAWBP蛋白表达水平，发现MAWBP组明显较正常对照组、Mock组高（图2A）；RT-qPCR检测MAWBP在肠道组织mRNA水平，发现MAWBP组明显高于提示Mock组（图2B）；这些都提示MAWBP成功转染到小鼠肠道组织，并使MAWBP表达上调。在此基础上，对各组小鼠进行疾病活动指数评分，发现MAWBP组评分低于Mock组（图2C），提示上调MAWBP表达有缓解肠炎作用。为了进一步证实MAWBP缓解肠道炎症水平作用，造模结束后，我们取直结肠组织进行组织切片、HE染色，镜下评估各组肠道炎症程度。镜下可见（图3）：①正常对照组小鼠结肠黏膜基本完整，腺体排列整齐、结构层次清晰，无明显炎性细胞浸润；②Mock组和MAWD组小鼠结肠黏膜破损严重，腺体减少、排列紊乱，以淋巴细胞为主的炎性细胞的大量浸润，淋巴滤泡增生；③MAWBP组小鼠结肠炎症相对较轻，黏膜基本完整，腺体结构清晰，炎细胞浸润相对较少；以上结果提示MAWBP在肠道炎症中起保护作用，一定程度上缓解了炎症的进展，而MAWD并没有此作用。

A：DSS制作急性溃疡性结肠炎模型期间小鼠肛周情况；

B：急性溃疡性结肠炎模型肠道组织HE切片染色（放大倍率：左上图100×，右上图100×，左下图400×，右下图200×）；

C：MAWBP蛋白在急性溃疡性结肠炎模型肠道组织表达情况。

图1　MAWBP蛋白在溃疡性结肠炎急性模型肠道组织低表达（NC：正常对照组，DSS：急性溃疡性结肠炎模型组）

（A）经慢病毒转染，MAWBP蛋白在肠道组织表达上调。（B）经慢病毒转染，MAWBP蛋白和mRNA在肠道组织表达上调。EGFP/NC：空载组mRNA与正常对照相比的倍数变化；MAWBP/NC：转染了含有MAWBP基因慢病毒的小鼠与正常对照相比体内目的蛋白mRNA的倍数变化（MAWBP/NC vs EGFP/NC，n=3，F=1701.256，P＜0.001）。（C）急性溃疡性结肠炎模型小鼠疾病活动指数评分（MAWBP组vsMock组，n=3，*P＜0.05）。

图2　上调MAWBP表达可减轻急性溃疡性结肠炎模型小鼠肠道组织炎症。

讨论

MAWBP（MAWD binding protein）是MAWD （mitogen-activated protein kinase activator with WD repeats）结合蛋白，是以MAWD为诱饵蛋白通过双杂交技术从人肝脏cDNA文库分离的蛋白，在人脑、肺脏、心脏、肝脏、胰脏和肾脏等组织器官中均有表达［6］，提示MAWBP参与细胞基本功能［7］。由于涉及MAWBP的研究少，MAWBP的生物学功能尚不明确。为了探讨MAWBP在溃疡性结肠炎中的作用，我们制作DSS相关的急性溃疡性结肠炎模型，发现MAWBP在小鼠模型肠道表达下调，这与我们前期在UC患者的研究相吻合［2］。另外，我们通过慢病毒载体转染MAWBP基因到小鼠肠道组织，使MAWBP在小鼠肠道组织过表达，发现与转染病毒空载体小鼠相比，过表达MAWBP的小鼠疾病活动指数评分和病理组织炎症程度均明显降低，说明上调MAWBP表达可以改善急性溃疡性结肠炎模型小鼠的病情，MAWBP对溃疡性结肠炎具有一定的治疗作用。鉴于DSS相关急性溃疡性结肠炎模型主要是通过直接损伤肠道基底隐窝上皮模拟人类溃疡性结肠炎［3］，因此我们推测，MAWBP可能是通过加速肠道上皮细胞增殖修复，抑制炎症因子释放而缓解病情进展。

相关研究表明，MAWBP在肝癌组织中低表达，且与患者病情预后相关，低表达提示肝癌组织低分化和高度恶性［8］。MAWBP在胃癌组织中也呈低表达［9］，低表达也提示胃癌细胞低分化［10］。我们的研究证实MAWBP在急性溃疡性结肠炎模型和UC患者肠道低表达，且表达水平与病情严重程度呈负相关［2］，提示MAWBP可作为溃疡性结肠炎病情活动的预测指标，表达水平越低提示病情越重。此外，上调MAWBP表达除了缓解溃疡性结肠炎外，还具有抑制肿瘤生长作用。肝癌中，上调MAWBP表达可抑制肝癌细胞生长增殖和侵袭能力［8］；胃癌中，上调MAWBP表达可促进胃癌分化，抑制胃癌细胞增殖、侵袭、转移、成瘤能力［10-11］；这些均提示MAWBP可能具有抗炎抗肿瘤发生的作用。

综上所述，本实验通过上调MAWBP表达缓解了急性溃疡性结肠炎模型小鼠病情，可通过调控MAWBP表达水平治疗溃疡性结肠炎。

放大倍率：

左上图40×和200×；

右上图40×和200×；

左下图100×和400×；

右下图40×和200×。

NC：正常对照组；

Mock：空载慢病毒；

MAWBP：转染含MAWBP基因的慢病毒；

MAWD：转染含MAWD基因的慢病毒。

图3　上调MAWBP表达可减轻急性溃疡性结肠炎模型小鼠肠道组织炎症，经慢病毒转染，各组肠道组织HE切片染色

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（本文编辑：李爱民）

The effect of MAWBP on acute colitis model in mice

CHEN Sheng-bo，LIU Yi，ZHI Fa-chao，ZHAO Xin- mei.Department of Gastroenterology，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangdong Provincial Key Laboratory of Gastroenterology，Guangzhou 510515，China

10.3969/j.issn.1672-2159.2016.03.001

510515广东省胃肠疾病重点实验室，南方医科大学南方医院消化内科

赵芯梅，E-mail：xmzhao914@163.com

国家自然科学基金（81402037）（81170341）

2016-05-15）