不同粘片剂对油茶叶片石蜡切片效果的影响

尚　坤，王承南，陈　昊，袁　源，谷战英*

(1.中南林业科技大学 经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙 410004；2. 中南林业科技大学 经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室，湖南 长沙 410004；3. 中南林业科技大学 经济林培育与利用湖南省2011协同创新中心，湖南 长沙 410004)



不同粘片剂对油茶叶片石蜡切片效果的影响

尚坤1,2,3，王承南1,2,3，陈昊1,2,3，袁源1,2,3，谷战英1,2,3*

(1.中南林业科技大学 经济林育种与栽培国家林业局重点实验室，湖南 长沙 410004；2. 中南林业科技大学 经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室，湖南 长沙 410004；3. 中南林业科技大学 经济林培育与利用湖南省2011协同创新中心，湖南 长沙 410004)

比较不同粘片剂处理对油茶叶片石蜡切片粘片效果的影响，优化植物石蜡切片粘片方法，笔者在制作油茶叶片石蜡切片过程中，用4种不同的粘片剂(甲醛明胶液、铬矾明胶液、明胶甘油液、蛋清甘油液)处理石蜡切片，比较其粘片效果.结果显示，经蛋清甘油液处理的切片的形态结构完整度最佳，切片完整率高，而且染色效果清晰.不使用粘片剂处理的切片，叶片结构完整度最低，染色效果一般.最终得到结论为蛋清甘油液是制作植物石蜡切片的理想粘片剂.

油茶;石蜡切片;粘片剂;植物组织

植物石蜡切片的制作过程并不复杂，但是能够影响切片质量的因素是多方面的[1]，例如材料固定、脱水、透明、浸蜡、粘片、脱蜡、染色、脱水等一系列步骤.要制作出高质量的切片其中每一个操作步骤都很重要，且均可影响切片的最终质量.在长期的科研实践中，笔者尝试了多种液剂作为粘片剂使用，其中包括甲醛明胶液、铬矾明胶液、明胶甘油液、蛋清甘油液等.最后总结出了植物石蜡切片的制作过程中主要实验步骤粘片的较好方法，直接影响了植物石蜡切片上植物组织结构的完整度和可观性，利于做出高质量的植物石蜡切片.

1　材料与方法

1.1材料

试验材料为赣无油茶无性系[2-3].选取新鲜成熟油茶叶片，并沿着叶片叶脉用锋利单面刀片迅速切出边长为0.5 cm的正方形叶块，其中叶脉一边宽度为另一边宽度的一半.选取边缘整齐，且叶肉无损伤的叶块，作为实验用材料，用FAA固定液(50%酒精90 mL+冰醋酸5 mL+40%甲醛5 mL)进行固定.

1.2试剂

100%酒精、40%甲醛、冰醋酸、甘油，均为分析纯，山东浩中化工科技有限公司；铬矾，为分析纯，天津市凯信化学工业有限公司；明胶，为分析纯，济宁宏伟化工有限公司；番红、固绿，均为超纯，合肥博美生物科技有限责任公司.

2　实验方法

实验采用常规石蜡切片制作方法[4]，不同材料除粘片外均进行相同处理，在固定所用的FAA液成分中，考虑到防止叶块收缩，选用50%浓度酒精；包埋所用石蜡熔点为62～64 ℃(实验时的环境温度在30 ℃左右)；染色使用番红、固绿；贴片封固剂采用中性树胶[5].

2.1甲醛明胶液

配制方法：使用少许蒸馏水(约80 mL)将明胶0.5 g加热溶解，待完全溶解后，加入40%甲醛2.5 mL，最后补充蒸馏水至100 mL备用.

将上述液体滴在清洁的载玻片上1～2滴，并涂抹均匀后烤干备用，可防止脱片.

2.2铬矾明胶液

配制方法：在250 mL烧杯中加60 mL左右蒸馏水，加入0.5g明胶，边加温边搅拌溶解明胶，待其完全溶解后，再加入铬矾0.05 g及蒸馏水至100 mL.

注意：涂胶时水温在60 ℃左右为最佳，如发现有肉眼可见残渣，应过滤后使用；待处理的载波片一定要洗干净，捞片后，防尘,在烘箱烘干(一定要烘干)即可，烘片时温度不可过高，40 ℃即可,否则片子上会出现明胶“晶体”，染色背景会很脏.

2.3明胶甘油液

配制方法：配制时用1.0 g明胶溶解于30 ℃的蒸馏水100 mL中(水浴锅中进行),溶解后加入石炭酸2.0 g(可不用)和甘油15 mL,搅拌均匀过滤,储存于玻璃瓶中；将上述液体滴在清洁的载玻片上1～2滴，并涂抹均匀烤干(40 ℃)备用.

2.4蛋清甘油液

取新鲜鸡蛋，在鸡蛋壳尖头破开一个0.5 cm的缺口，将缺口朝下，使蛋清自由流出到过滤漏斗中，最后过滤到烧杯里，用干净清洁的注射器抽取蛋清50 mL于可封口玻璃器皿中，并加入甘油50 mL，搅拌均匀备用[6].

2.5对照(无粘片剂)

不使用粘片剂，直接进行烘片、脱蜡、染色及封片处理.

3　结果与分析

3.1完整度

油茶的叶片横切面由中脉、上表皮、下表皮、海绵组织以及栅栏组织构成.叶片中脉在叶片的上表皮和下表皮均形成突起，中脉是由厚角组织、维管束和维管束鞘组成.厚角组织由较大的薄壁细胞构成; 维管束呈扇形，维管束鞘由 2 层薄壁细胞组成.维管束包含木质部、韧皮部和形成层 3 部分;木质部位于近轴端，韧皮部位于远轴端，且木质部多于韧皮部.

对4种不同的粘片剂处理的油茶叶片组织石蜡切片染色结果进行显微镜下观察,染色结果如图1所示.

图1　油茶叶片石蜡切片Fig.1　The paraffin sections of Camellia oleifera leaf

图1a为使用蛋清甘油液作为粘片剂得到的切片，其切片完整度要明显高于其他3种粘片剂；图1b为甲醛明胶液粘片剂；图1c为明胶甘油液粘片剂；图1d为铬矾明胶液粘片剂；图1e为无粘片剂.图1a的叶片横切面上中脉、上表皮、下表皮、栅栏组织以及海绵组织基本完好存在.使用甲醛明胶液和铬矾明胶液得到的切片，叶片横切面上部分表皮、栅栏组织以及海绵组织有缺失，中脉结构较完整.使用明胶甘油液得到的切片，叶片横切面上组织结构缺失较多.每种粘片剂各有200个切片，使用蛋清甘油液得到较完整的切片180个，甲醛明胶液121个，明胶甘油液106个，铬矾明胶液137个，对照组无粘片剂的有36个[7-8].实验结果列于表1.由此可以得出，使用蛋清甘油液作为粘片剂得到的切片，在完整度上要优于其他3种粘片剂.

表1　不同粘片剂对石蜡切片的影响

3.2清晰度

实验结果显示(图1、表1)，由4种粘片剂得到的油茶叶片切片，叶片中脉、上表皮、下表皮、栅栏组织以及海绵组织细胞结构都清晰可见.可以看到叶片中脉在叶片的上表皮处和下表皮处均形成了突起， 维管束呈扇形且维管束鞘是由 2 层薄壁细胞组成.蛋清甘油液得到的叶片切片清晰度要高于其他3种粘片剂得到的叶片切片，其中由甲醛明胶液作为粘片剂得到的叶片切片清晰度最差.

3.3染色情况

染色分析结果显示(图1、表1),油茶叶片石蜡切片制成后经显微镜下观察，发现染色对比均清晰可见，由番红、固绿染色分色清楚.叶片中脉呈明显红色，外部叶片组织呈现绿色[9].蛋清甘油液作为粘片剂得到叶片切片染色对比度较其他3种粘片剂好.其中甲醛明胶液得到的叶片切片染色对比度最差.

4　结束语

根据实验结果,发现粘片剂的选择会直接影响实验结果的观察和分析，直接影响到标本质量和染色结果.实验在材料脱石蜡的过程中会因为切片浸入各种溶液的次数较多,容易出现脱片的问题, 在粘片时使用适量的蛋清甘油液，较为明显地解决了脱片的问题, 使用蛋清甘油液一定要适量, 过少会使切片脱落, 过多则会使石蜡脱不干净, 在复染固绿的时候容易产生余色, 导致细胞组织结构模糊[10-11].使用蛋清甘油液作为粘片剂得到的油茶叶片石蜡切片，在粘片率、切片完整度、染色效果等方面，要比使用其他3种粘片剂得到的切片质量高.使用甲醛明胶液和铬矾明胶液作为粘片剂得到的切片，在粘片率以及细胞组织结构完整度上要比明胶甘油液好.但在染色方面不及明胶甘油液作为粘片剂.

此外，实验同样发现，通过相同粘片剂处理的样品，最后得到的石蜡切片效果也存在明显差别，这说明要想制备高质量的石蜡切片,人为的操作细节差异也会带来影响，每一个实验步骤都必须精益求精，这需要进行长期的摸索和实践；同时，该实验仅对粘片效果进行对比，其他如不同熔点石蜡选择、不同染色剂和染色时间选择没有涉及，这些都有待将来做更进一步的研究.

[1]侯春春, 徐水. 浅析影响石蜡切片质量的关键因素[J]. 中国农学通报, 2009, 25 (23): 94-98.

[2]王玉娟, 何小三, 敖婉初. 贮藏条件对赣无系列油茶花粉活力和萌发率的影响[J]. 经济林研究, 2014, 32 (2): 152-155.

[3]幸伟年, 周文才, 龚春. 油茶杂交育种试验[J]. 经济林研究, 2010, 28 (3): 95-99.

[4]杨捷频. 常规石蜡切片方法的改良[J]. 生物学杂志, 2006, 23 (1): 45-46.

[5]朱彬，钟海雁，曹清明. 油茶活性成分研究进展与展望[J]. 经济林研究, 2010, 28 (3): 140-145.

[6]王原媛, 张定宇, 黄春国. 植物石蜡切片的固定与保存[J]. 安徽农学通报, 2010, 16 (1): 198-200.

[7]李兵, 李登弟, 张杰, 等. 植物树脂半薄切片染色方法的改进[J]. 植物生理学报, 2011, 47 (12): 1207-1212.

[8]孙海梅, 尚宏伟, 张立新, 等. 不同固定液对大鼠脾石蜡切片HE染色标本的影响[J]. 中国医学装备, 2011, 8 (10): 48-50.

[9]朱登峰, 唐冬英, 李明芳, 等. 观察植物木质部的3种切片方法比较[J]. 湖南农业科学, 2010 (7): 20-22.

[10]钟海霞, 陆婷, 刘立强. 新疆野扁桃与栽培扁桃花原基解剖结构观察[J]. 经济林研究, 2013, 31 (3): 107-111.

[11]林翠翠, 张雯, 石卓功. 板栗花粉管生长特性[J]. 经济林研究, 2008, 26 (1): 86-89.

(责任编辑于敏)

The influence of different adhesive tablets of plant paraffin section

SHANG Kun1,2,3, WANG Chengnan1,2,3, CHEN Hao1,2,3,YUAN Yuan1,2,3, GU Zhanying1,2,3*

(1. The Key Lab of Non-wood Forest Products of State Forestry Administration,Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, China;2. The Key Lab of Cultivation and Protection for Non-wood Forest Trees of Education Ministry,Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, China;3. 2011 Cooperative Innovation Center of Cultivation and Utilization for Non-wood Forest Trees of Hunan Province,Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, China)

To compare the effects of different adhesive tablets of camellia leaves paraffin section stick piece, and optimizing paraffin slice method of plant, the authors used four different adhesive tablets in the process of making Camelliaoleiferaleaf paraffin section including formaldehyde gelatin, chrome alum gelatin, gelatin glycerin, glycerol egg white. The results showed with glycerol egg white treatment section morphological structure maintained integrity, best slice complete rate was high, and the dyeing effect was clear. The slice without adhesive tablets treatment had blade structure integrity, lowest dyeing effect. We could draw a conclusion that glycerol egg white was an ideal adhesive tablet production for making plant paraffin section.

camellia oleifera; paraffin section; adhesive tablets; plant tissue

10.3969/j.issn.1000-2162.2016.05.016

2016-02-29

林业科学技术推广项目(2014-51)；林业公益性行业科研专项(201104052)；引进国际林业先进科学技术项目(2014-4-26)

尚坤(1991-)，男，山西侯马人，中南林业科技大学硕士研究生；*谷战英(通信作者)，中南林业科技大学副教授，硕士生导师，博士，E-mail: guzhanying99@163.com.

Q94-336

A

1000-2162(2016)05-0105-04