miR-146a表达与肝细胞肝癌术后复发的相关性研究

吴其肯，刘玉君，王海江，王利平，梅勇

miR-146a表达与肝细胞肝癌术后复发的相关性研究

吴其肯，刘玉君，王海江，王利平，梅勇

目的研究miR-146a与肝细胞肝癌（HCC）术后复发的相关性以及其潜在分子机制。方法通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测miR-146a基因在HCC术后2年内复发的8例患者以及10例未复发患者癌组织样本内的表达情况。同时，利用三种交叉验证实验分析miR-146a的表达对HCC样本的术后复发预后的分型准确性。此外，进一步预测miR-146a下游调控基因，然后分析下游调控基因参与的生物学功能以及信号通路，探究miR-146a可能的分子机制。结果miR-146a在术后复发的HCC样本中表达高于未复发样本；交叉验证实验结果发现miR-146a对HCC样本有较好的分型准确率分别为73%、75%与72%；最后通过对miR-146a下游调控基因的功能富集分析发现，miR-146a基因参与到细胞增殖、RNA转录等HCC术后发展相关的功能与通路中。结论miR-146a具有良好的HCC术后复发预测效能，可做为HCC术后复发的潜在分子标志物。

miR-146a；肝细胞肝癌；术后复发；分子标志物

肝细胞癌（HCC）是对人类威胁最大的恶性肿瘤之一。在世界范围内，HCC的发病率与死亡率都非常高[1-2]。目前HCC的具体发病机制还远未阐明，这在很大程度上影响了HCC的早期诊断和治疗，同时HCC的术后复发率也是影响HCC生存率的重要因素[3]。因此，在HCC尚未出现复发转移之前，及早预测、诊断和治疗就成为提高HCC生存率的关键因素。而在肿瘤诊断领域，miRNA分子是近年来极为受到关注的分子之一，有研究表明miRNAs的表达模式与mRNA的表达模式相比，是更可靠的诊断指标[3]。本研究分别检测miR-146a在8例HCC术后2年内复发患者和10例未复发患者癌组织样本内的表达，并进一步分析miR-146a可调控的下游靶基因基因所涉及的生物学功能，希望明确miR-146a与HCC预后的相关，并探索其具体的分子机制。报道如下。

1　资料与方法

1.1HCC组织样本选取浙江省舟山市妇幼保健院 2010年内手术切除的HCC组织样本，筛选术后2年内复发的HCC患者组织样本8例，其中男6例，女2例；年龄58～71岁。筛选术后未复发的HCC患者组织样本10例，其中男6例，女4例；年龄52～73岁。所有样本速冻于液氮，－80℃冰箱保存。

1.2miR-146a表达检测组织总RNA提取常规按照 Trizol试剂说明书的步骤进行，并用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水溶解保存。cDNA合成按照逆转录试剂盒说明书进行加尾法逆转录，反应结束后将获得的10 lcDNA置于―80℃保存备用。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验按照miRNA SYBR Green PCR检测试剂盒说明书操作，反应体系共20 l，反应条件为：95℃15min后，以94℃15s，55℃30s，70℃34s进行40个循环，70℃时采集荧光信号，循环结束后绘制熔解曲线。每个反应均重复3次取平均值。以提取RNA时所加外参Cel-miR-39作为定量参照，用比较Ct值法计算目的基因的相对表达量。

1.3miRNA靶基因预测以及靶基因功能 分 析使 用targetScan、picTar、RNA22、PITA和miRanda 5种软件进行miR-146a下游靶基因预测，取至少3种软件同时预测得到的基因为 miR-146a靶基因，共得到40个靶基因。然后使用DAVID数据库分析靶基因所富集到的基因本体论（GO）功能与生物学通路。设定阈值为错误发现率（FDR）＜0.05。

1.4生物信息学分析使用R语言CMA包[4]分别进行留一交叉验证、十折交叉验证以及蒙特卡罗交叉验证计算miR-146a基因表达结果的样本分型准确性，验证实验重复1 000次，得到平均的分型准确率。采用R软件对结果进行数据分析，组间采用方差分析。＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1miR-146a在HCC组织中的表达miR-146a在HCC术后复发样本表达量8.19±1.22，在术后未复发样本中相对表达量 5.29±1.98，差异有统计学意义（=3.894，＜0.05）。见封四彩图8。

2.2miR-146a的分型准确性3种验证方法的分型准确率分别为73%、75% 和72%。见表1。2.3miR-146a下游调控基因以及相关功能的分析40个miR-146a靶向调控基因大量的富集到“细胞周期”、“细胞死亡”及“凋亡”等相关的生物学功能。同时，发现这些基因也富集到了“Notch信号通路”和“肿瘤通路”等肿瘤相关通路。见表2。

表1　miR-146a的分类效能

表2　miR-146a调控基因的功能富集分析结果

3　讨论

肝癌的总体预后很差，因此寻找新的更灵敏特异的肝癌预后标志物具有重要意义。目前研究已发现了大量与HCC发展相关的miRNA，例如miR-139及miR-122等[5-6]。miR-146a定位于基因组5q34，目前研究发现miR-146a在不同的消化系统肿瘤中的表达情况不一致，金丽艳等[7]与崔鹏等[8]分别报道miR-146a在食管癌与胰腺癌中表达显著上调，而Hou等[9]却发现miR-146a在胃癌中表达下调。这些结果可能说明miR-146a在不同的肿瘤中所参与的功能与分子机制不一致，其可能具有致癌以及抑癌双重功能。miR-146a在肝癌中的表达很少见于文献报道，且具体分子机制也远未清晰。本研究发现，miR-146a在预后差的HCC组织样本中明显的表达增高。证明其与HCC的预后明显相关，然后通过交叉验证发现 miR-146a的表达对HCC术后复发的预准确性与稳定性较好，预示该基因可做为HCC预后的潜在分子标志物。此外，通过进一步分析miR-146a下游调控基因参与的生物学功能与通路也侧面反映出miR-146a在HCC的术后复发过程中其重要作用。以上结果都显示miR-146a可做为HCC预后潜在分子标志物，且具有重要的研究价值。

本研究收集的样本量较少，需要更高样本量并多中心规模化的验证。在未来工作中，笔者将进一步筛选其他HCC相关的基因或者其他分子，并与miR-146a联合组成HCC预后诊断的分子标志物组合，以致力于显著增加HCC预后预测的普适性以及准确率，为最终将成果转化向临床应用做铺垫。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2015.02.035

R735.7

A

1671-0800(2015)02-0207-02

2015-03-20

（本文编辑：孙海儿）

316004浙江省舟山，舟山市妇幼保健院

刘玉君，Email:yujunliu 66@163.com