女性MTHFR和MTRR基因多态性分析

钟　超　任　峻　何纳新　孙　娜　顾优飞　韩秀群

·流行病学调查·

女性MTHFR和MTRR基因多态性分析

钟超任峻何纳新孙娜顾优飞韩秀群

目的 研究女性5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）C677T、A1298C和甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）A66G三个位点基因型分布特征。方法 用Taqman-MGB探针检测513例育龄女性MTHFR的C677T、A1298C位点和MTRR的A66G位点的基因序列，统计分析三个位点的基因多态性分布特征并与已研究报道的其他省份进行比较。结果 女性MTHFR C677T纯合突变基因型TT的频率为14.8%，高于海南省与广东省，低于山东省与河南省，差异有统计学意义（P＜0.05）。MTHFR A1298C纯合突变基因型CC的频率为6.6%，高于山东省与河南省。MTRR A66G纯合突变基因型GG的频率为5.7%，与海南省相比，差异有统计学意义（P=0.036），与山东、河南及广东相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 女性MTHFR与MTRR基因多态性分布特征不同于其他省份，检测其多态性可为制定育龄女性叶酸增补方案提供依据。

亚甲基四氢叶酸还原酶 甲硫氨酸合成酶还原酶 基因多态性

叶酸是水溶性B族维生素，在DNA合成、修复及甲基化的过程中发挥重要的作用。有研究表明，叶酸缺乏会导致DNA甲基化异常、DNA链断裂、染色体重组异常［1～3］。参与叶酸转运及代谢的关键酶包括5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）和甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR）。MTHFR与MTRR等基因的突变所引起的酶活性降低会导致血液中同型半胱氨酸（Hcy）的水平升高。有研究表明，Hcy水平升高与复发性流产、妊娠高血压等孕期疾病以及神经管缺陷（NTDs）、唇腭裂、先天性心脏病等出生缺陷密切相关［4～8］。本研究中检测浙江省舟山市孕龄女性MTHFR和MTRR的三个基因多态性位点。报道如下。

1　临床资料

1.1一般资料 选取浙江省舟山市普陀人民医院2013年2月至2014年8月进行孕前或孕期检查的女性为观察对象，选择标准为同意采取静脉血并且进行叶酸代谢相关基因遗传检测的人群。共获取有效样本513例，年龄16～44岁。

1.2方法 每名观察对象采取EDTA抗凝静脉血5ml，用血液基因组DNA提取试剂盒（上海莱枫生物技术有限公司）提取DNA，操作严格按照说明书进行。缓冲液TE溶解DNA，选取OD260/OD280值介于1.8～2.0之间者进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳条带清晰且条带＞23kb的基因组DNA作为实验样品。采用Taqman-MGB技术检测叶酸代谢相关的三个基因位点（MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G）的基因型。PCR仪以及试剂均购自Applied Biosystems（ABI）公司。PCR反应体系为10μl，包括2×Taqman Universal Master Mix 5μl，20×Taqman-MGB探针0.5μl，去离子水3.5μl以及浓度为20ng/μl的DNA模板1μl。用ABI 9700 进行PCR扩增反应，扩增条件是95℃ 10min预变性，扩增20个循环（92℃ 15s，60℃ 1min），随后再扩增30个循环（89℃ 15s，60℃ 90s），反应结束之后在荧光定量PCR仪（ABI7900）上读取每个样品孔内的终点荧光，并利用分析软件确定每个样本的基因分型结果。

1.3统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件。对所研究的舟山市女性人群进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验。对符合Hardy-Weinberg遗传平衡的人群进行基因型频率及等位基因频率统计，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1Hardy-weinberg平衡检验 对收集到的舟山市女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G三个位点基因分型统计数据进行Hardy-weinberg平衡检验，检验结果为MTHFR C677T：χ2=0.99，P=0.3197；MTHFR A1298C：χ2=2.92，P=0.0875；MTRR A66G：χ2=1.25，P=0.2636，三组统计数据差异均无统计学意义（P＞0.05），符合Hardy-weinberg平衡，表明本研究所选取的样本具有区域代表性。

2.2舟山市女性MTHFR和MTRR基因多态性分布特征 之前报道了山东、河南、 四川、海南及广东女性MTHFR、MTRR基因三个位点多态性分布数据［9～11］，采用本研究的舟山市统计数据与以上地区的数据两两进行比较，结果见表1、2。

3　讨论

出生缺陷是我国严重的公共卫生问题之一，2012年卫生部出生缺陷报告指出，我国出生缺陷发生率为5.6%左右，每年新增出生缺陷数约为90万例。舟山市2000～2006年出生缺陷率为120.3/万，这几年间，先天性心脏病、唇裂有/无唇腭裂及神经管畸形等出生缺陷一直位于前6位［12］。有病因学研究表明，先天性心脏病、唇裂有/无唇腭裂及神经管畸形等疾病均与MTHFR和MTRR基因位点多态性密切相关［13］。

表1　不同地区女性MTHFR、MTRR基因型频数及频率分布比较［n（%）］

表2　不同地区女性MTHFR、MTRR等位基因频数及频率分布比较［n（%）］

本文中，作者对舟山市育龄女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G 3个基因位点的多态性进行大样本分析，并与之前报道的山东省、河南省、四川省、海南省和广东省的研究数据进行对比分析，发现MTHFR C677T、A1298C的基因型频率和等位基因频率南北差异明显。C677T纯合突变基因型TT及等位基因T在北方省份（山东省、河南省）的分布频率比南方省份（舟山市、四川省、海南省、广东省）高。与MTHFR C677T基因型分布频率不同的是，MTHFR A1298C纯合突变基因型CC在北方省份的分布频率则比南方省份低。MTHFR C677T、A1298C和 MTRR A66G三个基因位点突变可能导致叶酸利用能力下降。临床研究表明，在叶酸摄入量无显著差异的情况下，677TT个体血清叶酸水平比TC、CC型个体低20 %左右，在血清叶酸浓度低时，MTHFR 677TT型比CC、CT型Hcy高30 %左右［14］。由于饮食差异，北方人群从日常饮食中摄取的叶酸比南方人群少［15，16］。在饮食差异和遗传因素共同作用下，北方新生儿出现出生缺陷的几率可能会升高。目前国内外孕妇叶酸补充剂量一般为0.4mg/d［17］，对于有叶酸代谢障碍风险的孕妇，叶酸补充剂量的确定应遵循个性化原则，可根据MTHFR C677T、A1298C和 MTRR A66G三个基因位点突变检测结果确定其叶酸增补剂量。了解各地人群的叶酸代谢相关基因的遗传分布特征，为各地制定有针对性的卫生政策提供依据，减少因叶酸缺乏而导致的出生缺陷疾病的发生，提高人口素质［18］。

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316100 浙江省舟山市普陀人民医院妇产科（钟超 何纳新 孙娜 顾优飞）

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（任峻 韩秀群）