低氧联合TNF-α对人肺微血管内皮细胞氧化应激及凋亡的影响*

吉圣珺，　郑劲平

广州医科大学附属第一医院呼吸科，广州　510120



低氧联合TNF-α对人肺微血管内皮细胞氧化应激及凋亡的影响*

吉圣珺，郑劲平△

广州医科大学附属第一医院呼吸科，广州510120

目的探讨低氧联合肿瘤坏死因子α(TNF-α)对人肺微血管内皮细胞(HPMVECs)氧化应激及凋亡的影响。方法低氧6、12、24 h及10、20、50、100 ng/mL TNF-α分别处理HPMVECs，使用MTT比色法检测各组的细胞活性；选用最佳的低氧时间及TNF-α剂量作为联合干预组，检测各组上清液的丙二醛(MDA)含量、乳酸脱氢酶(LDH)及超氧化物歧化酶(SOD)活力及细胞凋亡率。结果低氧及TNF-α联合干预组的MDA含量、LDH活力及细胞凋亡率明显高于单独作用组(均P<0.05)，而SOD活力低于单独作用组(均P<0.05)；且低氧24 h+TNF-α 100 ng/mL联合干预组的细胞凋亡率最高(P<0.05)。结论低氧联合TNF-α作用于HPMVECs后，细胞的氧化应激及凋亡率明显增加。

人肺微血管内皮细胞；氧化应激；凋亡

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是常见的严重危害人类健康的呼吸系统疾病。肺动脉高压(pulmonary hypertension，PH)作为其主要并发症之一，被认为是影响COPD预后的独立危险因素[1]，而其发生机制又与肺动脉血管内皮细胞的凋亡密切相关[2]。低氧及炎症因子的持续存在是慢性阻塞性肺疾病具有的重要特征，两者均可通过介导和调控肺血管重构，参与肺动脉高压的形成[3-4]。既往许多关于肺动脉高压模型的研究，无论是动物还是体外细胞模型，大部分以低氧、野百合碱或者炎症因子作为单一诱导因素[5-6]，然而，对于COPD患者的肺动脉高压而言，低氧与炎症因素往往同时存在。当两者同时作用于人肺微血管内皮细胞(HPMVECs)后，将产生何种效应，目前尚未明确。本文拟通过低氧和肿瘤坏死因子α(TNF-α)对HPMVECs进行单独或联合刺激，进一步探讨两者作为联合诱导因素在致HPMVECs损伤过程中的作用。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

电热恒温培养箱、低氧细胞培养箱购自上海博讯实业公司、台式高速离心机购自中科中佳科学仪器有限公司；美国BD Accuri C6流式细胞仪、恒温水浴锅购自上海有典仪器设备公司；722型分光光度计、微量移液枪购自赛默飞世尔科技公司；96孔细胞培养板、胎牛血清、高糖培养液、0.25%胰蛋白酶、HPMVECs购自上海细胞库，甲基噻唑基四唑盐(MTT)、细胞培养液购自Gibco公司，Annexin Ⅴ-FITC试剂盒为凯基公司产品，四乙氧基丙烷、2，4-二硝基苯肼及冰乙酸购自上海榕柏生物技术有限公司。

1.2人肺微血管内皮细胞的体外培养

从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化，将细胞悬液移入15 mL离心管，加入5 mL培养液，离心(1 000 r/min，5 min)，用培养液混悬沉淀细胞，每2～3 d换液1次，待细胞生长至80%融合时用胰酶消化法，按1/2(体积比)分瓶传代，用第4代细胞进行实验。HPMVECs在37°C、5%(体积分数)CO2培养箱中培养。

1.3细胞实验分组及构建缺氧损伤模型

实验分为4组：①空白对照组；②低氧干预组，分别低氧6 h、12 h、24 h；③TNF-α干预组，分别加入TNF-α 10、20、50、100 ng/mL进行干预；④低氧+TNF-α联合干预组，具体浓度根据②③MTT结果设定。构建缺氧损伤模型：按实验分组处理细胞并待细胞贴壁后，将细胞放入特制容器中，容器外接2根管道，其中一根管道进气，另一根管道出气，向进气口中持续通入含5%CO2、0～5%(体积分数)O2的混合气体，并将出气口通入水中防止外界O2进入容器中，容器其他部位均密封。将容器放入水浴锅中，调节水浴锅温度，实时监测容器中实际温度，保证容器中温度为(37±2)℃。

1.4细胞生长抑制率的检测

MTT比色法测定各组细胞的活性。收集对数生长期细胞，调整细胞数；以4000个/孔细胞接种到96孔板中。37℃、5%CO2条件下孵育1 d；弃去培养液，分别加入蒸馏水溶解，提取5%FBS培养液200 μL，每个浓度重复3个平行样，37℃、5%CO2条件下孵育48 h，倒置显微镜下观察。按上述实验分组方法处理细胞。吸干培养液，每孔加入20 μL MTT溶液，继续孵育4 h，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL DMSO溶液，置摇床上低度振荡10 min，用酶标仪检测490 nm波长各孔的吸光度(A)值。细胞活力=(处理组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%。

1.5细胞丙二醛(MDA)含量、乳酸脱氢酶(LDH)及超氧化物歧化酶(SOD)活力的测定

取造模后各组培养液，用黄嘌呤氧化酶法测定细胞培养液的SOD含量，改良硫代巴比妥法测定细胞培养液的MDA含量，比色法测定细胞上清液中LDH含量，分别读取各组培养液吸光度值，根据试剂盒说明书计算各培养液中MDA含量、SOD及LDH活力。

1.6人肺微血管内皮细胞凋亡的检测

每组取3个6孔板的培养孔，胰酶消化法(不含EDTA)收集细胞，1 000 g离心5 min，弃上清，PBS液重悬细胞后，离心，重复2次后弃上清。分别加入缓冲液200 μL重悬并进行细胞计数，调整细胞数至105个/mL。取200 μL细胞悬液，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC混匀，室温避光孵育10 min。再加入5 μL PI染液混匀，流式细胞仪进行检测。

1.7统计学处理

2　结果

2.1细胞生长抑制率的检测

2.1.1低氧干预组低氧6 h、12 h组与空白对照组的相对细胞活力比较差异无统计学意义，但显示有逐步下降的趋势，而低氧24 h组的相对细胞活力明显低于空白对照组(P=0.041)，见表1。

表1　不同低氧刺激时间组HPMVECs的活力比较

与空白对照组比较，*P<0.05

2.1.2TNF-α干预组10、20、50 ng/mL TNF-α处理组与100 ng/mL TNF-α处理组间差异均有统计学意义(均P<0.05)，而TNF-α 100 ng/mL的相对细胞活力明显低于空白对照组(P=0.006)，TNF-α对细胞活力的抑制与TNF-α浓度呈现剂量依赖关系，见表2。

2.1.3低氧联合TNF-α干预组根据以上结果，选择低氧24 h及TNF-α 100 ng/mL作为联合干预组，与低氧24 h、TNF-α 100 ng/mL单独作用组比较，低氧24 h+TNF-α 100 ng/mL联合干预组的相对细胞活力更低，差异有统计学意义(P值分别为0.002、0.005)，见表3。

表2　不同TNF-α浓度刺激组HPMVECs的活力比较

与空白对照组比较，aP<0.05；与TNF-α 10 ng/mL组比较，bP<0.05；与TNF-α 20 ng/mL组比较，cP<0.05；与TNF-α 50 ng/mL组比较，dP<0.05

2.2细胞MDA含量、LDH和SOD活力的测定结果

与空白对照组相比，低氧24 h组、TNF-α 100 ng/mL组、低氧24 h+TNF-α 100 ng/mL联合干预组的MDA含量及LDH活力均升高(均P<0.05)，SOD活力均降低(均P<0.05)，其中联合干预组的MDA含量和LDH活力升高更明显，而SOD活力则更低，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表4。

表3　各实验组HPMVECs的活力比较

与空白对照组比较，aP<0.05；与低氧24 h组比较，bP<0.05；与TNF-α 100 ng/mL组比较，cP<0.05

表4　各实验组MDA含量、LDH和SOD的活力比较

与空白对照组比较，aP<0.05；与低氧24 h组比较，bP<0.05；与TNF-α 100 ng/mL组比较，cP<0.05

2.3Annexin Ⅴ-PI法检测细胞凋亡的结果

与空白对照组相比，低氧24 h组、TNF-α 100 ng/mL组及低氧24 h+TNF-α 100 ng/mL联合干预组均可导致细胞的凋亡率升高，差异存在统计学意义(均P<0.05)，其中低氧24 h+TNF-α联合干预组与低氧或TNF-α 单独作用组相比，细胞凋亡率增加更为明显(P值分别为0.0007、0.0008)，见图1。

A：空白对照组；B：低氧24 h组；C：TNF-α 100 ng/mL组；D：低氧24 h+TNF-α 100 ng/mL联合干预组；与空白对照组比较，*P<0.05；与低氧24 h组比较，#P<0.05；与TNF-α 100 ng/mL组比较，△P<0.05图1　各实验组细胞凋亡率的比较Fig.1 Comparison of the apoptosis rate in different groups

3　讨论

肺动脉高压的发病机制复杂，对于COPD患者而言，低氧以及炎症因子的刺激被认为是主要影响因素之一，两者均可通过引起肺血管收缩及重构导致肺动脉高压的发生；在进一步的研究中发现，两者引起的血管内皮细胞凋亡，继而肺血管内皮的损伤，是肺动脉高压发生的重要机制和起始环节[7-8]。

氧化应激(oxidative stress，OS)是指机体组织或细胞内的氧自由基生成增加或清除能力降低，引起氧化损伤的过程。SOD可反映细胞清除氧自由基的能力，MDA是氧自由基与生物膜上不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的产物，其水平可反映细胞脂质过氧化反应程度，因此在氧化应激过程中伴有MDA、LDH的释放增加及SOD的含量减少。已有研究显示，低氧可通过减少NO生成、钙超载等引起氧化损伤[9-10]，而COPD的氧化应激还与TNF-α炎症途径密切相关，已有动物实验证实肺动脉高压的转基因小鼠体内TNF-α表达明显增加[11]。我们的研究结果显示，低氧24 h组、TNF-α 100 ng/mL组均出现MDA含量、LDH活力的升高以及SOD活力的降低，其中低氧24 h+TNF-α联合干预组的MDA含量及LDH活力最高，而SOD活力则最低。

内皮细胞凋亡在血管生理性和病理性重构以及逆转重构中起着重要作用，与肺动脉高压的形成密切相关[12]。无论在肺动脉高压的动物模型还是低氧、野百合碱(Monocrotaline，MCT)等相关危险因素诱发肺动脉高压的体外细胞模型中[5-6]，均可发现血管内皮细胞的凋亡数量明显增加，而通过减少某些促凋亡因素(如低氧血症、心房利钠肽等)，可使HPMVECs凋亡率降低，从而减轻缺氧所造成的HPMVECs损伤，延缓肺动脉高压的发展[13]。在本研究中发现，低氧24 h后，细胞生长率明显受到抑制，而TNF-α组中，细胞生长抑制率与TNF-α浓度呈现剂量依赖关系。根据以上结果，选择了低氧24 h及TNF-α 100 ng/mL作为联合干预组，在进一步的细胞凋亡检测中发现，与单独作用组相比，低氧24 h+TNF-α联合干预组的细胞凋亡率最高。

综上所述，低氧联合TNF-α作用于HPMVECs后，可使细胞的氧化应激及凋亡率明显增加，证实了低氧联合TNF-α作为复合因素刺激比其单一因素刺激，对HPMVECs损伤更明显，该体外细胞模型的建立，更客观地呈现出COPD患者肺动脉高压时HPMVECs的真实状态。尽管目前有许多研究证实了PI3K、P38MARK、ERK、STAT3等信号通路在血管内皮细胞凋亡中的作用，但是，在不同刺激因素及不同血管内皮细胞模型下，是否存在不同的信号转导通路以及信号通路间是否存在交叉反应，尚需要更深入的研究进一步阐明。

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(2015-10-27收稿)

Influence of Hypoxia Combined with Tumor Necrosis Factor-α on the Apoptosis and Oxidative Stress in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

Ji Shengjun，Zheng Jingping△

DepartmentofRespiratoryDiseases，TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou510120，China

ObjectiveTo explore the influence of hypoxia combined with tumor necrosis factor-α(TNF-α)on the apoptosis and oxidative stress in human pulmonary microvascular endothelial cells(HPMVECs).MethodsHPMVECs were treated by hypoxia for 6，12，or 24 h and then with TNF-α at concentration of 10，20，50，or 100 ng/mL.MTT was used to detect the cell viability in each group.The contents of malondialdehyde(MDA)，activities of lactate dehydrogenase(LDH)and superoxide dismutase(SOD)，and the apoptosis rate were determined in the combined treatment group which had the optimal treatment time of hypoxia and concentration of TNF-α.ResultsThe contents of MDA，the activities of LDH and the apoptosis rate were significantly higher and the activity of SOD was significantly lower in the combined treatment group than in single treatment group(P<0.05 for all).The apoptosis rate was highest in the 24 h hypoxia+100 ng/mL TNF-α treatment group.ConclusionThe oxidative stress and apoptosis rate are significantly increased in HPMVECs treated with hypoxia and TNF-α combined.

human pulmonary microvascular endothelial cells；oxidative stress；apoptosis

，Corresponding author，E-mail：jpzhenggy@163.com

R322.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.010

*广东省佛山市卫生及计生委医学科研立项课题(No.2015255)

吉圣珺，女，1982年生，主治医师，E-mail：670942334@qq.com