TRAF4沉默对食管癌细胞Eca-109增殖、凋亡及细胞周期的影响

蒋　鸣，　翟祥军，　徐　池，　周国仁

1 江苏省肿瘤医院放疗科，南京　2100092江苏省疾病预防与控制中心，南京　210009



TRAF4沉默对食管癌细胞Eca-109增殖、凋亡及细胞周期的影响

蒋鸣1，翟祥军2，徐池1，周国仁1

1江苏省肿瘤医院放疗科，南京2100092江苏省疾病预防与控制中心，南京210009

目的探讨小干扰RNA(siRNA)靶向沉默肿瘤坏死因子受体相关因子4(TRAF4)基因表达对人食管癌细胞恶性行为的影响。方法选取对数生长期Eca-109细胞并行脂质体法高效转染2条靶向沉默TRAF4的siRNA(siTRAF4-1、siTRAF4-2)，采用实时定量PCR检测转染后的TRAF4 mRNA水平以筛选沉默效果较好的siRNA为沉默组，同时设阴性对照组(转染阴性siRNA序列)和空白对照组。采用噻唑蓝(MTT)法检测转染24、48、72、96 h的吸光度值以计算各组增殖抑制率，Annexin Ⅴ-FITC/PI双染、Caspase-3 FITC单染或PI单染流式细胞术检测转染后的凋亡率、Caspase-3活化率和细胞周期分布情况。结果靶向沉默TRAF4 24～96 h内，转染siTRAF4-1、siTRAF4-2的Eca-109细胞中TRAF4 mRNA水平均低于未转染或转染对照siRNA的细胞，且转染siTRAF4-1、siTRAF4-2后的沉默率均高于转染对照siRNA的细胞(均P<0.05)；后续试验选取沉默率较高的siTRAF4-1进行研究。与空白对照组和阴性对照组相比，沉默组的增殖抑制率、凋亡率及Caspase-3活化率均升高，差异有统计学意义(均P<0.05)；沉默组转染96 h的G0/G1期细胞比例高于空白对照组和阴性对照组，而S、G2/M期细胞比例低于其余两组，以上差异均有统计学意义(均P<0.05)；空白对照组和阴性对照组以上指标的差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论通过siRNA靶向沉默TRAF4基因表达的效果较好，可抑制细胞增殖并诱导凋亡、Caspase-3活化和细胞周期G0/G1期阻滞，为食管癌靶向治疗提供了方法学基础。

小干扰RNA；肿瘤坏死因子受体相关因子4；食管癌细胞Eca-109；增殖；凋亡

食管癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，在我国属于高发肿瘤之一，尽管目前在食管癌诊断、治疗上有较大发展，但预后仍不尽人意[1]。恶性肿瘤发生发展过程中涉及多个基因的异常表达，故探讨影响食管癌恶性行为的关键基因成为靶向治疗的重点[2]。肿瘤坏死因子受体相关因子4(Tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF4)在人乳腺癌转移淋巴结中首次被发现，与其他TRAF家族成员调节免疫和炎症反应不同，该因子被证实参与了多种肿瘤的发生发展[3-5]，但目前TRAF4在食管癌中的作用效果及方式尚不清楚。本研究采用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)技术靶向沉默人食管癌细胞Eca-109细胞中TRAF4的表达，在体外水平研究靶向沉默TRAF4基因对Eca-109细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响，为TRAF4基因靶向治疗提供实验依据。

1　材料与方法

1.1细胞和主要试剂

食管癌细胞Eca-109购于中科院上海细胞库，RPMI 1640细胞培养液、胰蛋白酶为Gibco BRL公司产品，Trizol试剂为美国Invitrogen公司产品，四甲基偶氮唑盐(MTT)、转染脂质体LipofectamineTM2000为美国Sigma公司产品，胰蛋白酶为福州迈新生物技术有限公司产品，膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒为南京凯基公司产品，FITC标记的Caspase-3试剂盒为美国BD公司产品。2条TRAF4 siRNA片段由GenePharma公司设计并合成，其中siTRAF4-1正义链：5′-ATCCGAAAG-CAGTGTGAACACTCCTTTCTTTCGTTAGGC-TTGAATGAAGAACGAG-3′，反义链：5′-AGC-AATAGTCGGTTCTGATTTCCAGTCTTACCA-AAGCGTTAGGAACCGCGAAATTC-3′；siTRAF4-2正义链：5′-CGAATCCTGATTTCTAGGATGCTAACAGTCGTAACACACGAGTCTCGTTTTGTA-ATGATGG-3′，反义链：5′-CTACCGTCAAGAA-ATCTAAGTTGATTCCGTGTCCTATTCCCGT-TGGTTAACAAGGACGAATC-3′。

1.2细胞培养

将冻存的Eca-109从液氮罐中取出，迅速复苏后采用RPMI 1640培养液(含体积分数10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素)进行培养，置于CO2无菌培养箱中培养，培养条件维持在温度37 ℃、CO2体积分数为5%及饱和湿度。培养48 h后首次半量换液，之后每3天换液1次。待细胞融合度达80%以上时可进行后续实验。

1.3siRNA转染及实验分组

取100 μL无血清培养液2份，分别加入脂质体LipofectamineTM转染试剂和siRNA溶液，室温孵育5 min后将两者混匀，进行Eca-109细胞的转染操作，当siRNA终浓度为10 nmol/L、脂质体Lipofectamine为1.75 μL/mL时的siRNA转染效率达90%以上。将Eca-109培养液更换成无血清培养液后分别加入含2条靶向沉默TRAF4的siRNA载体片段(siTRAF4-1、siTRAF4-2)的转染混合液(沉默组)，同时设阴性对照组(转染阴性siRNA序列)和空白对照组(仅加Lipofectamine 2000)。在siRNA转染后24、48、72和96 h采用荧光定量RT-PCR(qPCR)检测Eca-109细胞中的TRAF4 mRNA水平变化，以选取沉默效果较好的siRNA片段进行后续研究。

1.4细胞增殖活性检测

取处于对数生长期Eca-109细胞，制成密度为4.5×104/mL的细胞悬液，按照每孔100 μL接种至96孔板中，CO2培养箱常规条件培养24 h后进行siRNA转染，每组设3个复孔，分别于转染24、48、72和96 h后每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，混匀后继续培养4 h，吸弃上清后每孔加入100 μL二甲基亚砜，待结晶物充分溶解后，采用全自动酶标仪在492 nm波长处测定各孔吸光度值(A)，根据下述公式计算增殖抑制率：抑制率(%)=(空白对照组A值-阴性对照组或沉默组A值)/空白对照组A值×100%。

1.5流式细胞术检测凋亡率及Caspase-3活化率

将对数生长期Eca-109细胞的密度调整至2×106/mL，接种于6孔培养板中(每孔2 mL)，常规条件下培养48、96 h后收集细胞并等分为两部分：①加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL PI，避光于冰上孵育10 min后，将细胞重悬后将样品逐一上机检测，每组设3个复孔，计算凋亡率；②FITC标记的Caspase-3抗体染色后，上机检测Caspase-3活化率。每个实验重复3次。

1.6流式细胞术检测细胞周期

收集各组转染96 h的Eca-109细胞，采用胰蛋白酶消化后，经PBS重悬后用乙醇进行固定30 min，用含RNase和PI的染色液染色30 min，上机进行细胞周期分析，采用软件分别计算不同周期(G0/G1、S、G2/M)细胞数目占细胞总数的百分比。

1.7统计学分析

2　结果

2.1siRNA靶向沉默TRAF4的效果分析

由图1A可见，qPCR检测转染24、48、72、96 h后的TRAF4 mRNA水平发现，在靶向沉默TRAF4 24 h后即可发现其mRNA水平降低，且在24～96 h观察时间内转染siTRAF4-1、siTRAF4-2的Eca-109细胞中TRAF4 mRNA水平均低于未转染或转染siRNA的Eca-109细胞，差异均有统计学意义(均P<0.05)；图1B显示，以未转染的Eca-109细胞为参照，转染siTRAF4-1、siTRAF4-2后的抑制率均高于转染对照siRNA的细胞，差异有统计学意义(均P<0.05)；鉴于siTRAF4-1转染96 h的抑制率高于siTRAF4-2(P<0.05)，故后续试验选择siTRAF4-1片段进行功能学研究。

A：TRAF4的相对表达量；B：抑制率；与Eca-109同时间组比较*P<0.05；与Eca-109-siRNA同时间组比较△P<0.05图1　siRNA靶向沉默TRAF4的效果分析Fig.1 Effect of siRNA targeted silencing of TRAF4 gene

2.2siRNA靶向沉默TRAF4对细胞增殖的影响

MTT法检测结果显示，靶向沉默TRAF4可抑制细胞增殖，沉默组的增殖抑制率均高于空白对照组和阴性对照组，且抑制率随转染时间的延长而升高，以上差异均有统计学意义(均P<0.05)；空白对照组和阴性对照组增殖抑制率的差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1　siRNA靶向沉默TRAF4对细胞增殖的影响

与空白对照组比较，*P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05

2.3siRNA靶向沉默TRAF4对细胞凋亡率的影响

AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术检测结果显示，靶向沉默TRAF4可促进细胞凋亡，沉默组转染48、96 h的凋亡率均高于空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；空白对照组和阴性对照组凋亡率的差异无统计学意义(均P>0.05)。见表2、图2。

表2　siRNA靶向沉默TRAF4对细胞凋亡率的影响

与空白对照组比较，*P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05

A：空白对照组；B：阴性对照组；C：沉默组图2　各组转染96 h后细胞凋亡检测的流式图Fig.2 Flow chart of cell apoptosis at 96 h after transfection in each group

2.4siRNA靶向沉默TRAF4对细胞Caspase-3活化的影响

Caspase-3 FITC单染流式细胞术检测结果显示，靶向沉默TRAF4可促进细胞Caspase-3活化，沉默组转染48、96 h的Caspase-3活化率均高于空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；空白对照组和阴性对照组Caspase-3活化率的差异无统计学意义(均P>0.05)。见表3、图3。

表3　siRNA靶向沉默TRAF4对细胞

与空白对照组比较，*P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05

A：空白对照组；B：阴性对照组；C：沉默组图3　各组转染96 h后细胞Caspase-3活化检测的流式图Fig.3 Flow chart of Caspase-3 activation at 96 h after transfection in each group

2.5siRNA靶向沉默TRAF4对细胞周期的影响

PI单染流式细胞术检测结果显示，靶向沉默TRAF4可诱导细胞周期G0/G1期阻滞，沉默组转染96 h的G0/G1期细胞比例高于空白对照组和阴性对照组，而S、G2/M期细胞比例低于其余两组，以上差异均有统计学意义(均P<0.05)；空白对照组和阴性对照组细胞周期分布的差异无统计学意义(P>0.05)。见表4、图4。

组别G0/G1SG2/M空白对照组51.09±3.6229.70±2.1919.02±1.75阴性对照组53.48±4.1727.31±2.6620.37±2.34沉默组82.63±5.12*#11.54±1.53*#7.12±0.97*#

与空白对照组比较，*P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05

A：空白对照组；B：阴性对照组；C：沉默组图4　各组转染96 h后细胞周期检测的流式图Fig.4 Flow chart of cell cycle at 96 h after transfection in each group

3　讨论

TRAF为一类重要的胞质衔接蛋白，主要参与肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的信号传导[6]。此外TRAF家族可以直接或间接地与TNFR的胞质部分结合，调节多种信号通路，从而调节细胞的增殖、存活，分化与凋亡[7]。TRAF4为该家族中参与肿瘤调控的一个因子，目前多数研究发现TRAF4在乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤中高表达。Yang等[8]发现TRAF4可通过Wnt-β-catenin信号通路促进口腔鳞状细胞癌细胞的生长、侵袭和迁移。通过基因载体手段改变TRAF4表达水平可影响癌细胞的恶性行为，如李伟等[9]的研究发现采用慢病毒感染的基因手段来沉默TRAF4表达，可抑制结直肠癌细胞SW620生长，同时对Akt活化及糖酵解过程均有较强抑制效果，而张晓丽等[10]通过载体过表达乳腺癌细胞中的TRAF4水平发现，MDA-MB-231的细胞增殖能力增强，同时可增加S期细胞比例，以上结果提示靶向TRAF4可为肿瘤防治提供新思路，但目前TRAF4在食管癌中的作用尚不清楚，故本研究选取常用的食管癌Eca-109细胞为对象，研究靶向沉默TRAF4对其增殖、凋亡及细胞周期的影响。

经2条靶向沉默TRAF4的siRNA载体转染后，本研究发现siTRAF4-1、siTRAF4-2转染后的TRAF4基因表达受抑制，提示TRAF4靶向沉默成功，连续观察发现该沉默方法效果较为持久且沉默率较高，为进一步研究沉默TRAF4对食管癌Eca-109细胞恶性行为的影响，故后续选择96 h沉默率可达90%以上的siTRAF4-1片段。恶性肿瘤的基本特征之一为无限增殖，即增殖能力不受控制，本研究采用MTT法发现siTRAF4转染后的吸光度值降低，以未转染细胞为参照发现，沉默组的增殖抑制率亦随转染时间的延长而升高，表明沉默TRAF4基因表达可达到抑制Eca-109细胞增殖的效果。Yao等[11]的研究也发现沉默TRAF4可在体内和体外抑制骨肉瘤细胞生长，与本研究结果一致。此外，有研究发现下调TRAF4水平可达到抑制非小细胞肺癌进展的效果[12]，以上结果表明靶向沉默TRAF4细胞对抑制恶性肿瘤生长有较好前景。

细胞凋亡是一种细胞自主生理性死亡过程，其启动和执行的发生过程受机体的精确调控，而恶性肿瘤细胞的凋亡失衡，也是抗肿瘤治疗的关注点[13-15]。与对照组相比，siRNA靶向沉默TRAF4后的细胞凋亡率升高，转染96 h后的凋亡率升高为对照组的8倍左右，表明靶向沉默TRAF4具有显著的凋亡促进效果。凋亡蛋白酶Caspase-3信号激活是导致凋亡的主要途径[16]，而Caspase-3活化率也是评价凋亡作用的主要指标[17]，与凋亡率的结果一致，siTRAF4转染后的Caspase-3活化率较对照组升高，以上表明靶向沉默TRAF4可通过促进Caspase-3活化来发挥促凋亡效果。细胞周期紊乱是肿瘤的基本特征，也是肿瘤防治的重要切入点[18]。本研究发现靶向沉默TRAF4基因表达后，绝大部分的Eca-109细胞处于G0/G1期，仅少部分处于S、G2/M期，表明TRAF4对细胞周期有负性调控作用，推测可能与其影响细胞周期调节蛋白表达有关，下一步将进行重点研究。

综上所述，通过siRNA靶向沉默TRAF4基因表达的效果较好，可抑制细胞增殖并诱导凋亡、Caspase-3活化和细胞周期G0/G1期阻滞，为食管癌靶向治疗提供了方法学基础，后续研究将在动物实验中进行验证。

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(2016-02-01收稿)

Effects of TRAF4 Silencing on the Proliferation，Apoptosis and Cell Cycle of Esophageal Cancer Cell Line Eca-109

Jiang Ming1，Zhai Xiangjun2，Xu Chi1etal

1DepartmentofRadiotherapy，JiangsuCancerHospital，Nanjing210009，China2JiangsuProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention，Nanjing210009，China

ObjectiveTo investigate the effects of small interfering RNA(siRNA)targeted silencing of tumor necrosis factor receptor associated factor 4(TRAF4)gene on the malignant behaviors of human esophageal cancer cells.MethodsEca-109 cells at the logarithmic growth phase were transfected with 2 siRNAs targeting TRAF4(siTRAF4-1 and siTRAF4-2)by using liposomes.Real-time quantitative PCR was used to detect the TRAF4 mRNA level after transfection in order to screen out the siRNA with better silencing effect.Besides，the negative control group(cells transfected with negative siRNA sequence)and blank control group were set up.The absorbance(A)value at 24，48，72 and 96 h after transfection were measured by MTT assay as to calculate the inhibition rate of cell proliferation.Annexin Ⅴ-FITC/PI double staining，Caspase-3 FITC single staining and PI single staining were used to detect the apoptosis rate，Caspase-3 activation rate and cell cycle distribution，respectively.ResultsIn Eca-109 cells transfected with siTRAF4-1 or siTRAF4-2，TRAF4 mRNA levels were much lower than those without transfection or transfected with control siRNA within 24-96 h post transfection.The silencing rates of cells transfected with siTRAF4-1 or siTRAF4-2 were significantly higher than those transfected with control siRNA(allP<0.05).siTRAF4-1 with higher silencing rate was selected for the follow-up experiment.The proliferation inhibition rate，apoptosis rate and Caspase-3 activation rate were increased in silencing group as compared with those in the blank control group and negative control group，and the differences were statistically significant(allP<0.05).Ninety-six hours after transfection，the proportion of cells at G0/G1phase was found to be higher and the proportions of cells at S and G2/M phase to be lower in silencing group than those in blank control group and negative control group(allP<0.05).There were no significant differences between the control group and the negative control group in the aforementioned indicators(allP>0.05).ConclusionSilencing TRAF4 gene expression by siRNA could inhibit the proliferation and induce the apoptosis，Caspase-3 activation and G0/G1phase arrest of esophageal cancer cells，which provides a methodological basis for targeted therapy of esophageal cancer.

small interfering RNA；tumor necrosis factor receptor associated factor 4；esophageal cancer cell Eca-109；proliferation；apoptosis

R735.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.007

蒋鸣，男，1971年生，副主任医师，E-mail：xiaojiduoduo@163.com