薏苡仁油对HCT116细胞血管生成拟态形成的影响及机制*

余　涛，　刘　礼，　吕秀玮，　贺文煜，　袁昌劲

华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院中西结合肿瘤科，武汉430014



薏苡仁油对HCT116细胞血管生成拟态形成的影响及机制*

余涛，刘礼，吕秀玮，贺文煜，袁昌劲△

华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院中西结合肿瘤科，武汉430014

目的观察薏苡仁油(CLSO)对人结肠癌HCT116细胞血管生成拟态形成能力的影响，并观察CLSO对细胞迁移能力和迁移诱导蛋白-7(Mig-7)表达水平的影响，藉此探讨CLSO影响血管生成拟态形成的可能机制。方法MTT法检测CLSO对HCT116的无毒浓度(增殖抑制率<10%时的浓度)，选取无毒浓度以下不同浓度的CLSO作用于三维培养的HCT116细胞，观察其对HCT116细胞形成血管生成拟态的影响；并用划痕实验观察各组细胞的迁移能力，蛋白印迹法检测各组中Mig-7蛋白的表达水平。结果体外三维培养环境下，经CLSO作用的HCT116细胞形成血管生成拟态的结构比对照组减少。划痕实验中对照组、CLSO 5和10 μL/mL浓度组的平均迁移距离依次缩小，迁移率分别为17.07%、9.19%、2.10%，2个实验组和对照组相比差异均有统计学意义(均P<0.05)。蛋白印迹法检测显示经不同浓度CLSO作用于HCT116细胞后实验组条带灰度值/内参条带灰度值的比值比对照组小，Mig-7蛋白表达受到抑制，其中10 μL/mL浓度组的抑制作用比5 μL/mL组更明显，二者差异有统计学意义(P<0.05)。结论CLSO体外对HCT116形成血管生成拟态的能力存在抑制，其机制可能与下调Mig-7蛋白表达，从而影响细胞的迁移能力有关。

薏苡仁油；结肠癌；血管生成拟态；细胞迁移；迁移诱导蛋白-7

薏苡仁油(coix seed oil，CLSO)是从中药薏苡仁中提取的脂质成份。前期临床研究表明该药对肠癌有效，具体作用表现在抗炎消肿[1]，抑制肿瘤细胞增殖并诱导凋亡[2]，辅助化疗减毒增效[3]，减少放疗造成的组织损伤[4]以及调整免疫功能[5]等方面。而抑制肿瘤血液供应也是抗肿瘤治疗的重要策略，但是关于CLSO影响肿瘤血供的研究却较少。目前发现有内皮血管和血管生成拟态2种管道为肿瘤提供血液[6]。前期研究发现CLSO可以影响肿瘤内皮血管生成[7]，其机制与CLSO影响血管内皮细胞增殖和VEGF表达有关[8]。本实验则是以人结肠癌细胞株(HCT116)为研究对象，观察CLSO对血管生成拟态的影响。由于肿瘤细胞迁移是血管生成拟态形成过程中的必要环节，而迁移诱导蛋白-7(migration induced protein-7，Mig-7)是调控血管生成拟态的关键分子[9]，本实验中同时观察CLSO对细胞迁移能力和Mig-7表达的影响，旨在进一步探讨CLSO抑制血管生成拟态的可能机制。

1　材料与方法

1.1材料

人结肠癌细胞株(HCT116)由上海中医药大学附属普陀医院中心实验室提供。DMEM高糖型培养液和胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；鼠尾Ⅰ型胶原购自杭州生友生物技术有限公司；薏苡仁油购自陕西森朗生物化工有限公司；噻唑蓝(MTT)购自Sigma公司；DMSO(分析纯)购自北京博大泰恒有限公司；兔抗人Mig-7多克隆抗体购自Abcam公司，内参GAPDH兔抗人多克隆抗体购自杭州至贤生物科技有限公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多克隆抗体购自R&D公司；RIPA细胞裂解液购自日本TaKaRa公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；酶标仪、电泳仪、半干法转膜仪和凝胶成像系统均为Bio-Rad品牌；其余蛋白印迹法所需试剂耗材均购自碧云天生物技术研究所。

1.2细胞培养

HCT116细胞常规复苏后，以完全培养液(含10%胎牛血清，10万U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM培养液)培养于含5% CO2、37℃及饱和湿度的培养箱中，适时换液、传代，连续培养。

1.3MTT法检测CLSO对HCT116细胞的无毒浓度

无毒浓度为增殖抑制率<10%的浓度。取对数生长期的HCT116细胞，常规清洗、消化、收集、吹打重悬，制成密度为(1～5)×104/mL的单细胞悬液，加入96孔板中，每孔100 μL。置培养箱中24 h，待细胞贴壁，弃去旧培养液，将CLSO先用DMSO溶解，再用新培养液稀释(DMSO的终浓度小于3‰)，使终浓度依次为0、10、20、40、80、160、320 μL/mL，空白组加入等量培养液，每组设5个复孔，置于培养箱中培养。48 h后终止培养，每孔加入20 μL MTT溶液，置于培养箱中孵育4 h后，去原培养液，每孔加入DMSO 200 μL，摇床上摇晃10 min，酶标仪读取参考波长490 nm，检测波长570 nm处各孔的吸光度值(A)，并按公式计算抑制率：细胞生长抑制率=1—(实验组平均A值—空白组平均A值)/(对照组平均A值—空白组平均A值)×100%。实验重复3次。软件计算IC10，作为CLSO对HCT116的无毒剂量。

1.4三维培养观察血管生成拟态形成

参照文献[10]的方法，预先在无菌6孔板板底铺加200 μL鼠尾Ⅰ型胶原，静置凝固。再将对数生长期的HCT116常规消化，以2×106/孔的密度加入6孔板中，同时分别加入培养液和CLSO稀释液，使终体积为3 mL/孔，终浓度为0、5、10 μL/mL。置培养箱中培养36 h，用PAS染色法显示管状结构后拍照。

1.5划痕实验

参照文献[11]的方法，预先在24孔板中铺鼠尾Ⅰ型胶原150 μL/孔。CLSO用无血清的培养液稀释成0、5、10 μL/mL，分别预处理HCT116 24 h。再将处理后的HCT116以5×105个/mL的密度接种于各孔，置培养箱中培养。至形成单细胞层时，用黄色移液器吸头在板底划“一”字痕，镜下拍照；继续培养12 h再次拍照，用IMAGE软件计算划痕距离，并计算细胞迁移率(%)=(1—培养后的划痕距离/初始距离)×100%。

1.6蛋白印迹法检测Mig-7蛋白表达

同1.4中的分组和三维培养方法，培养36 h后将细胞置冰上，用预冷PBS洗3遍，加入含有PMSF的RIPA裂解液，收集各孔总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，取总蛋白量相等的样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后电转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭后加入一抗(1∶2 000)，4℃孵育过夜，加入二抗(1∶10 000)，室温孵育2 h，化学发光(ECL)试剂盒显色，暗室中曝光于胶片。经凝胶成像系统拍照并行灰度分析，以目标蛋白条带灰度值/内参条带灰度值的比值表示目标蛋白的相对表达量。

1.7统计分析方法

采用SPSS 22.0统计软件对实验数据进行统计分析。实验重复3次以上，实验数据以均数±标准差表示。

2　结果

2.1CLSO作用于HCT116细胞的无毒剂量

MTT实验结果如图1所示，经不同浓度CLSO干预后，HCT116细胞增殖能力受到不同程度抑制。经计算，CLSO处理HCT116细胞48 h的IC50=119.87 μL/mL，IC10=14.63 μL/mL。

2.2CLSO对HCT116细胞血管生成拟态形成的影响

通过三维培养形成的管腔结构如图2所示，对照组中可见HCT116在模拟细胞外基质的胶原上形成大量完整的VM结构。而CLSO 5 μL/mL浓度组中，完整VM结构明显减少，10 μL/mL浓度组则几乎未见到完整的VM结构。

2.3CLSO对HCT116细胞迁移能力的影响

划痕实验检测CLSO对HCT116细胞迁移能力的影响，结果如图3所示，经不同浓度CLSO作用后的HCT116细胞迁移能力受到不同程度抑制。对照组、5和10 μL/mL浓度组的平均迁移距离依次缩小，迁移率分别为17.07%、9.19%、2.10%。两实验组和对照组相比，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

图1　不同浓度CLSO对HCT116细胞增殖的影响Fig.1 Effects of different concentrations of CLSO on the migration of HCT116 cells

A：CLSO 0 μL/mL；B：CLSO 5 μL/mL；C：CLSO 10 μL/mL图2　不同浓度CLSO对HCT116细胞形成VM结构的影响(PAS染色，×40)Fig.2 Effects of different concentrations of CLSO on the VM formation in HCT116 cells(PAS staining,×40)

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2.4CLSO对HCT116细胞Mig-7蛋白表达的影响

蛋白印迹法检测不同浓度CLSO作用于HCT116细胞后Mig-7的蛋白表达水平，结果如图4所示，和对照组相比，实验组条带灰度值/内参条带灰度值的比值依次变小，可见Mig-7蛋白表达受到抑制，其中10 μL/mL浓度组的抑制作用比5 μL/mL更明显，二者差异有统计学意义(P<0.05)。

1：CLSO 0 μL/mL；2：CLSO 5 μL/mL；3：CLSO 10 μL/mL图4　不同浓度CLSO对HCT116细胞Mig-7蛋白表达的影响Fig.4 Effects of different concentrations of CLSO on the expression levels of Mig-7 protein in HCT116 cells

3　讨论

薏苡仁是一味传统中药材，在消化系统肿瘤尤其是肠癌中药处方中被广泛应用，对该药抗癌成分和机制的研究日趋增加。薏苡仁油即是从薏苡仁中提取的脂质。经过大量的临床观察和基础实验验证，该药具有多方面的抗癌功效，如抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、对放化疗减毒增效、调整患者的免疫能力等等。由于肿瘤生长和转移依赖血液供应，因此如何阻断肿瘤血供已成为肿瘤治疗的研究热点。之前曾有学者通过薏苡仁油作用于主动脉环研究该药对血管生成的影响，还有学者研究该药对人视网膜血管内皮细胞增殖和VEGF表达的影响[8]，均证实薏苡仁油对血管形成存在抑制，这也可能是其抗癌机制之一。

传统观点认为输送血液的管道必须有内皮细胞参与构成，即经典的内皮依赖性血管。然而1999年Maniotis在研究黑色素瘤时发现了一种新型的肿瘤供血管道，它不依赖内皮细胞，而由肿瘤细胞通过自身表型和胞外基质重塑围成，遂将之命名为血管生成拟态(VM)。后来的研究证实肠癌中也存在VM结构，并且与肠癌的预后存在关联[12]。VM作为传统微循环结构的补充，和内皮依赖性血管一起为肠癌的生长和转移提供必要条件[13]。因此本文主要观察薏苡仁油对VM的影响，以从抑制肠癌微循环的角度了解薏苡仁油的抗肿瘤机制。由于薏苡仁油的细胞毒作用可在体外培养环境中引起细胞死亡导致VM无法形成，所以文中采用MTT法测定细胞抑制率为10%时的浓度为无毒浓度，分组所选浓度均小于无毒浓度，以排除干扰。同时采用三维培养模拟肠癌细胞在体内生长的微环境。实验结果显示，薏苡仁油体外可以抑制肠癌VM形成，增大剂量可提高抑制效果(图2)。

VM形成需要经历一个复杂的过程。肿瘤细胞表现出高度的可塑性，经过去分化后具备内皮细胞表型，再经过迁移、变形、分解并重塑细胞外基质，最终形成和宿主循环系统相连接[14]。由此可见，细胞的迁移能力决定着最终VM结构的形成。本实验通过划痕实验初步观察了薏苡仁油对HCT116细胞在三维培养时迁移能力的影响，结果显示经过薏苡仁油作用后细胞迁移能力受到抑制，这在一定程度上可以解释薏苡仁油抑制VM形成的机制。而这一系列过程又受到众多信号通路和分子的调控，如缺氧诱导因子(HIF)、内皮细胞生长因子(VEGF)、黏着斑激酶(FAK)、基质金属蛋白酶(MMPs)、迁移诱导蛋白7(Mig-7)，层黏蛋白(LN)等[9]。其中Mig-7是一种富含半胱氨酸的蛋白质，它分布在细胞膜上和内皮细胞钙粘蛋白相邻，可促进层黏蛋白5γ2片段形成，增加基质金属蛋白酶2的表达，这些均是VM形成的重要条件，因此在VM形成过程中起重要调控作用[15]。本文采用免疫印迹法检测HCT116细胞经CLSO干预后Mig-7的表达情况(图3)。实验发现CLSO可以抑制Mig-7的表达，初步推测CLSO抑制Mig-7表达也可能是其影响VM形成的原因之一。

综合以上结果和分析，CLSO抗肿瘤的作用机制是多方面，多靶点的。不同于当前抗肿瘤药物研制追求单一靶点，我国天然抗肿瘤药物研发成果多数具有多靶点多机制的特点，这和肿瘤的发生发展机制相契合。虽然针对单一靶点的效果不突出，但多靶点的干预方式能有效防止肿瘤耐药现象的发生，且副作用较小，有着广阔的临床应用前景。

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(2015-06-19收稿)

Effect of Coix Seed Oil on the Vasculogenic Mimicry Formation of HCT116 Cells

Yu Tao，Liu Li，Lv Xiuweietal

DepartmentofOncology，WuhanCentralHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430014，China

ObjectiveTo investigate the effect of coix seed oil(CLSO)on the expression of migration-induced protein-7(Mig-7)and migration of HCT116 colorectal cancer cells in an attempt to examine the possible mechanism underlying the effect of CLSO on vasculogenic mimicry(VM)formation.MethodsMTT assay was used to detect the non-toxic concentrations of CLSO to HCT116 cells(the inhibition rate<10%).CLSO at non-toxic concentrations was added to HCT116 cells in 3D cultureinvitroto observe the effect of CLSO on VM formation.Wound healing assay was used to detect the ability of cell migration.And the expression levels of Mig-7 proteins were measured by Western blotting.ResultsThe VM structures developed in CLSO-treated HCT116 cells in 3D culture were much less than those in control group.In wound healing test，the average migration distance was decreased in 5 μL/mL and 10 μL/mL groups progressively.The migration rates were 17.07%，9.19% and 2.10% in 5 μL/mL CLSO，10 μL/mL CLSO and control groups，respectively，with the difference found between the two experimental groups and the control group(P<0.05).Western blotting showed the ratio of the gray value of the experimental group against that of the internal reference was smaller than that of the control group，indicating that the Mig-7 expression was inhibited by CLSO.The effect was more obvious in 10 μL/mL CLSO group than in 5 μL/mL CLSO group(P<0.05).ConclusionCLSO can inhibit the VM formationinvitroby down-regulating the cell migration and expression of Mig-7 protein.

coix seed oil；human colon cancer；vasculogenic mimicry；cell migration；migration-induced protein-7

，Corresponding author，E-mail：13607169125@139.com

R735.35

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.015

*武汉市卫计委科研资助项目(No.WZ14Z17，No.WZ15Z07)

余涛，男，1986年生，博士研究生，E-mail：yutao1986cn@163.com