敲低LRP1基因对TNF-α诱导的大鼠软骨细胞损伤的影响*

杨二平，　彭　飞，　梁　杰，　杜远立

1三峡大学人民医院，宜昌市第一人民医院骨科，宜昌4430002武汉大学人民医院骨科，武汉430060



敲低LRP1基因对TNF-α诱导的大鼠软骨细胞损伤的影响*

杨二平1，彭飞2，梁杰1，杜远立1

1三峡大学人民医院，宜昌市第一人民医院骨科，宜昌4430002武汉大学人民医院骨科，武汉430060

目的探讨大鼠软骨细胞膜蛋白低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)对炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的大鼠软骨细胞损伤的影响。方法将慢病毒包装的LRP1-shRNA转染原代培养的软骨细胞。转染3 d后使用ERK磷酸化抑制剂PD098059(10 μmol/L)和P38磷酸化抑制剂SB203580(10 μmol/L)分别预处理对照组和shLRP1组软骨细胞30 min，再以TNF-α(30 ng/mL)作用软骨细胞30 min，收集总蛋白行Western blot检测软骨细胞MAPKs通路蛋白和凋亡蛋白表达。收集经TNF-α(30 ng/mL)作用12 h的软骨细胞培养液，采用ELISA法检测MMP-13表达水平。结果经TNF-α作用后，shLRP1组软骨细胞MAPKs通路蛋白ERK、P38活性、MMP-13表达均较对照组明显提高，且可以被PD098059和SB203580所拮抗(均P<0.05)；凋亡蛋白Caspase-3和Bax表达较对照组有明显提高，抑凋亡蛋白p-Akt和Bcl-2表达较对照组明显降低(均P<0.05)。结论在TNF-α诱导的大鼠软骨细胞损伤中，敲低LRP1表达可激活MAPK通路，上调MMP-13表达和促进细胞凋亡，LRP1有望成为骨关节炎治疗的靶点。

骨关节炎；软骨细胞；低密度脂蛋白受体相关蛋白1；MAPKs信号通路；细胞凋亡；MMP-13；肿瘤坏死因子-α

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种慢性退行性骨关节疾病，是中老年人常见、多发的骨关节病，据统计世界范围内因此有超过10%的60岁以上的老年人身体健康受到影响[1]。该病以局灶性关节软骨的退行性变、骨赘形成和软骨下骨质硬化为病理特点。骨关节炎的滑膜组织可产生促炎性细胞因子和其他炎性介质，IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是其中2个主要的炎性因子[2]，TNF-α被认为是软骨退变的关键炎性调节因子。这些炎性因子通过滑液扩散到关节软骨表面，激活软骨细胞产生多种酶降解软骨基质，这些酶包括基质金属蛋白酶(MMPs)和去整合素金属蛋白酶(ADAMTS)[3]，MMP-13是其中重要的软骨组织降解酶。骨关节炎软骨退变的另一种表现是软骨细胞凋亡，但软骨细胞凋亡在软骨退变过程中发挥多大作用仍未明确。最近的研究表明低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)除了参与脂质代谢外，还参与调节炎症反应[4]。LRP被认为有可能参与调节骨关节炎发病进程。本研究拟通过敲低LRP1表达，探讨其在炎症因子TNF-α诱导的大鼠软骨细胞损伤中的作用机制。

1　材料与方法

1.1主要实验材料

抗大鼠LRP1单克隆抗体购自美国Epitomics公司；DMEM/F12细胞培养液、胎牛血清购自Gibco公司；重组TNF-α购自Peprotech公司。一抗P38、p-P38、Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2、Caspase-3购自美国Bioworld公司，ERK、p-ERK购自美国赛信通公司；GAPDH购自美国Epitomics公司；二抗horseradish peroxidase(HRP)conjugated抗兔IgG、抗山羊IgG抗体购自武汉博士德公司。ERK磷酸化抑制剂PD098059购自美国Sigma-Aldrich公司，P38磷酸化抑制剂SB203580购自上海碧云天生物公司。大鼠基质金属蛋白酶-13(MMP-13)ELISA试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司。

1.2实验方法

1.2.1软骨细胞的培养原代细胞来自1周龄大鼠膝关节软骨经过酶消化法获得，以3×106/mL细胞密度接种于含10%胎牛血清的DMEM/F12细胞培养液中，置于37℃、5%CO2孵箱内培养，细胞生长至约80%融合时传代。

1.2.2shLRP1构建利用PUBMED网站提供的LRP1基因编码mRNA碱基序列(序号001130490.1)，设计LRP1目的靶位点序列5′-GCATTGGCGTGCAGCTTAA-3′，并根据文献[5]提供的靶点序列验证RNA干扰序列有效性。同时还采用RNA干扰实验中公认序列如siRNA阴性对照(negative control，NC)Scramble序列(5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)作为实验对照。以慢病毒为载体的shRNA由上海吉凯基因化学技术有限公司构建。

1.2.3软骨细胞的转染选择传代1次的细胞为转染细胞，细胞计数并以2.0×105/mL接种于6孔板。8 h后观察细胞贴壁良好，根据接种前细胞计数加入适量的慢病毒载体，MOI值为20。12 h更换新鲜培养液。转染3 d后荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达情况，根据转染效率，进入后续实验。待6孔板中软骨细胞铺满后更换无血清培养液DMEM过夜，将PD098059(10 μmol/L)和SB203580(10 μmol/L)分别加入培养液中预处理30 min，再加入TNF-α(30 ng/mL)作用软骨细胞30 min，收集细胞行Western blot检测。TNF-α(30 ng/mL)作用软骨细胞12 h后收集培养液行ELISA检测。

1.2.4Western blot检测TBS冲洗细胞后加入适当体积的RIPA裂解细胞。12 000 g离心5 min，收集上清，即为总蛋白溶液。测蛋白含量，计算含40 μg蛋白的溶液体积即为上样量。在蛋白标本中加入适当体积的5×蛋白上样缓冲液。沸水浴5 min。SDS-PAGE电泳(浓缩胶电压75 V，分离胶电压120 V)，转膜(200 mA，1 h)，用5%的脱脂牛奶(0.5%TBST配)封闭1 h。加入稀释一抗(TBST溶解的5%脱脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%BSA)，4℃孵育过夜。TBST室温下洗3次，每次5 min。将二抗用TBST稀释3 000倍，室温下孵育30 min后，用TBST洗3次，每次5 min。显色曝光。扫描显影后所得条带，采用BandScan图像分析软件分析胶片灰度值。

1.2.5ELISA检测收集经过TNF-α(30 ng/mL)作用12 h后的培养液，10 000 r/min离心20 min，小心吸取上清至EP管。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。分别加入样品稀释液、标准品、待测样品各100 μL。37℃孵育90 min。弃去液体，甩干，每个孔中加入Detection Ab工作液100 μL(在使用前15 min内配制)，37℃温育1 h。加HRP Conjugate工作液(临用前15 min内配制)100 μL，37℃温育30 min。加底物溶液90 μL，酶标37℃避光孵育15 min。加终止液50 μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的吸光度(A)值。

1.3统计学方法

2　结果

2.1大鼠关节软骨细胞转染shLRP1后LRP1的表达水平

软骨细胞转染3 d后镜下观察报告基因GFP的表达情况，发现软骨细胞状态良好，GFP的表达阳性率大于70%。收集总蛋白行Western blot检测目的基因表达，结果显示在MOI值为20时，目的靶位点能有效抑制LRP1蛋白表达水平。确认干扰序列可有效干扰LRP1蛋白表达(图1)。

图1　RNA干扰后关节软骨细胞中LRP1蛋白表达Fig.1 LRP1 expression in chondrocytes transfected with shRNA

2.2低表达LRP1对MAPKs通路蛋白表达的影响

2.2.1软骨细胞ERK信号通路相关蛋白表达Western blot检测TNF-α作用于转染与未转染

shLRP1的软骨细胞后，信号通路蛋白ERK、p-ERK的表达，以及两组细胞在ERK磷酸化抑制剂PD098059预处理后p-ERK的表达变化。结果如图2所示：在TNF-α作用后，shLRP1+TNF-α组细胞中p-ERK表达较control+TNF-α组明显增加，该增加可被PD098059抑制。

2.2.2软骨细胞P38信号通路相关蛋白表达Western blot检测TNF-α作用于转染与未转染shLRP1的软骨细胞后，P38信号通路蛋白P38、p-P38的表达，以及两组细胞在P38磷酸化抑制剂SB203580预处理后p-P38的表达情况。如图3所示，在TNF-α作用后，shLRP1+TNF-α组细胞中p-P38表达较control+TNF-α组明显增加，且该增加可被SB203580抑制。

1：control；2：control+TNF-α；3：control+TNF-α+PD098059；4：shLRP1+TNF-α；5：shLRP1+TNF-α+PD098059；与shLRP1+TNF-α组比较，*P<0.05图2　LRP1对软骨细胞在TNF-α作用下ERK磷酸化表达的影响Fig.2 Effect of LRP1 on the phosphorylation of ERK in chondrocytes induced by TNF-α

1：control；2：control+TNF-α；3：control+TNF-α+SB203580；4：shLRP1+TNF-α；5：shLRP1+TNF-α+SB203580；与shLRP1+TNF-α组比较，*P<0.05图3　LRP1对软骨细胞在TNF-α作用下P38磷酸化表达的影响Fig.3 Effect of LRP1 on the phosphorylation of P38 in chondrocytes induced by TNF-α

2.3低表达LRP1对MMP-13水平的影响

ELISA检测显示，经TNF-α诱导的软骨细胞，shLRP1+TNF-α组的细胞外MMP-13水平明显高于相应的control+TNF-α组，而这种变化可被PD098059和SB203580拮抗(图4)。

2.4低表达LRP1对凋亡相关蛋白表达的影响

Western blot检测TNF-α作用前后shLRP1组和未转染对照组软骨细胞凋亡相关蛋白Akt、p-Akt、Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达。结果如图5所示：在TNF-α作用前后shLRP1组p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax均低于相应的control组，Caspase-3/GAPDH均明显高于相应control组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

与shLRP1+TNF-α组比较，*P<0.05图4　ELISA检测软骨细胞LRP1低表达前后MMP-13分泌的变化Fig.4 ELISA for the defection of effect of LRP1 on the expression level of MMP-13 in chondrocytes

A、B：Western blot电泳图；C～E：灰度值比分析；*P<0.05;1：control；2：control+TNF-α；3：shLRP1；4：shLRP1+TNF-α图5　两组细胞经TNF-α作用后Akt、p-Akt、Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达变化Fig.5 Changes of the expression levels of Akt，p-Akt，Caspase-3，Bcl-2 and Bax in chondrocytes in the two groups

3　讨论

与骨关节炎相关的炎症介质中，TNF-α是主要的促炎性因子之一，在骨关节炎患者关节滑液中的含量增加，它能通过激活MAPKs通路而诱导MMP-13的表达，在关节软骨退变中发挥重要作用[6-9]，还可通过直接和间接方式诱导软骨细胞凋亡。本研究在大鼠软骨细胞培养时加入TNF-α以模拟骨关节炎时的软骨细胞损伤。低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP1)不仅参与识别和内吞脂质，而且能识别大量非脂质体，参与不同生理过程[10-11]。LRP1可识别尿激酶和组织纤溶酶原激活物及相应抑制剂，通过调节细胞膜尿激酶受体(uPAR)，LRP1控制uPAR下游信号因子的活性，包括胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶(ERK/MAP)[11]。LRP1通过多种机制实现对细胞信号通路的调控作用，MAPKs通路是其中重要通路之一。同时LRP1也可调节MMPs水平[12]，其中MMP-13是骨关节炎软骨组织重要降解酶。软骨细胞受到炎症因子刺激时，MAPKs通路(ERK-1/2和P38)对维持软骨细胞分化和稳定起着重要作用[13-15]，抑制ERK的活性可以延缓软骨细胞肥大骨化[16-18]。炎症反应和细胞因子水平在骨关节炎病变过程起着重要作用，可以诱导蛋白多糖激酶和MMPs合成与活性[19-20]。在本研究中我们分别选用MAPKs通路中P38和ERK的磷酸化抑制剂SB203580和PD098059来验证LRP1对该通路信号蛋白磷酸化以及MMP-13表达的作用。软骨细胞在敲低LRP1表达后，在TNF-α诱导下P38和ERK磷酸化水平明显提高，同样软骨细胞分泌MMP-13增加，SB203580和PD098059可明显抑制P38和ERK磷酸化，并通过抑制P38和ERK磷酸化来抑制软骨细胞分泌MMP-13。故LRP1可能通过抑制MAPKs通路来调低TNF-α的炎症反应，减少软骨细胞外基质MMP-13表达。

为了验证LRP1对TNF-α诱导的凋亡反应的影响，我们采用Western blot检测凋亡蛋白和抑凋亡蛋白的表达，结果显示LRP1低表达的软骨细胞经TNF-α作用后凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达明显增加，而Akt的磷酸化和Bcl-2表达明显降低，提示LRP1通过抑制多种凋亡蛋白的表达来促细胞生存和抗凋亡作用。包括MAPKs通路在内，有多种信号通路参与凋亡调节。LRP1低表达的软骨细胞有可能是通过激活MAPKs通路来增强TNF-α诱导的凋亡反应[21-23]。

综上所述，基于我们对体外培养的软骨细胞的研究，发现LRP1可抑制TNF-α诱导的软骨细胞的炎症反应和凋亡反应，其对骨关节炎样反应的软骨细胞具有保护作用，LRP1有望成为骨关节炎治疗的靶点。因LRP1分子量较大，并含有多个亚基，将来需进一步探讨LRP1保护机制是否有其他重要的通路参与。

[1]Hunter D J，Schofield D，Callander E.The individual and socioeconomic impact of osteoarthritis[J].Nat Rev Rheumatol，2014，10(7)：437-441.

[2]Kapoor M，Martel-Pelletier J，Lajeunesse D，et al.Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis[J].Nat Rev Rheumatol，2011，7(1)：33-42.

[3]Goldring M B，Marcu K B.Cartilage homeostasis in health and rheumatic diseases[J].Arthritis Res Ther，2009，11(3)：224-239.

[4]Mengshol J A，Vincenti M P，Coon C I，et al.Interleukin-1 induction of collagenase3(matrix metalloproteinase 13)gene expression in chondrocytes requires p38，c-Jun N-terminal kinase，and nuclear factor kappaB：differential regulation of collagenase 1 and collagenase 3[J].Arthritis Rheum，2000，43(4)：801-811.

[5]Campana W M，Li X，Dragojlovic N，et al.The low-density lipoprotein receptor-related protein is a pro-survival receptor in Schwann cells：possible implications in peripheral nerve injury[J].J Neurosci，2006，26(43)：11197-11207.

[6]Gaultier A，Arandjelovic S，Niessen S，et al.Regulation of tumor necrosis factor receptor-1 and the IKK-NF-κB pathway by LDL receptor-related protein explains the antiinflammatory activity of this receptor[J].Blood，2008，111(11)：5316-5325.

[7]Raggatt L J，Jefcoat S C Jr，Choudhury I，et al.Matrix metalloproteinase-13 inuences ERK signalling in articular rabbit chondrocytes[J].Osteoarthritis Cartilage，2006，14(7)：680-689.

[8]Manicourt D H，Poilvache P，Van Egeren A，et al.Synovialuid levels of tumor necrosis factor alpha and oncostatin M correlate with levels of markers of the degradation of crosslinked collagen and cartilage aggrecan in rheumatoid arthritis but not in osteoarthritis[J].Arthritis Rheum，2000，43(2)：281-288.

[9]Lawrence M C，Jivan A，Shao C，et al.The roles of MAPKs in disease[J].Cell Res，2008，18(4)：436-442.

[10]Herz J，Dudley K.Strickland：LRP：a multifunctional scavenger and signaling receptor[J].J Clin Invest，2001，108(6)：779-784.

[11]Gaultier A，Simon G，Niessen S，et al.LDL receptor-related protein 1 regulates the abundance of diverse cell-signaling proteins in the plasma membrane proteome[J].J Proteome Res，2010，9(12)：6689-6695.

[12]Barmina O Y，Walling H W，Fiacco G J，et al.Collagenase-3 binds to a specific receptor and requires the low density lipoprotein receptor-related protein for internalization[J].J Biol Chem，1999，274(42)：30087-30093.

[13]Liacini A，Sylvester J，Li W Q，et al.Induction of matrix metalloproteinase-13 gene expression by TNF-α is mediated by MAP kinases，AP-1，and NF-κB transcription factors in articular chondrocytes[J].Exp Cell Res，2003，288(1)：208-217.

[14]Greenblatt M B，Shim J H，Glimcher L H.Mitogen-activated protein kinase pathways in osteoblasts[J].Annu Rev Cell Dev Biol，2013，29：63-79.

[15]Zhen X，Wei L，Wu Q，et al.Mitogen-activated protein kinase p38 mediates regulation of chondrocyte differentiation by parathyroid hormone[J].J Biol Chem，2001，276(7)：4879-4885.

[16]Bobick B E，Kulyk W M.Regulation of cartilage formation and maturation by mitogen-activated protein kinase signaling[J].Birth Defects Res C Embryo Today，2008，84(2)：131-154.

[17]Han Y S，Bang O S，Jin E J，et al.High dose of glucose promotes chondrogenesis via PKC and MAPK signaling pathways in chick mesenchymal cells[J].Cell Tissue Res，2004，318(3)：571-578.

[18]Stanton L A，Beier F.Inhibition of p38 MAPK signaling in chondrocyte cultures results in enhanced osteogenic differentiation of perichondral cells[J].Exp Cell Res，2007，313(1)：146-155.

[19]Abramson S B，Attur M，Yazici Y.Prospects for disease modication in osteoarthritis[J].Nat Clin Pract Rheumatol，2006，2(6)：304-312.

[20]Pelletier J P，Martel-Pelletier J，Abramson S B.Osteoarthritis，an inammatory disease：potential implication for the selection of new therapeutic targets[J].Arthritis Rheum，2001，44(6)：1237-1247.

[21]阮丽萍，刘健，葛瑶，等.：骨关节炎大鼠软骨PI3K/Akt-mTOR及Beclin-1自噬通路的表达及相关性分析[J].华中科技大学学报：医学版，2015，44(4)：429-433,439.

[22]Cagnol S，Chambard J C.ERK and cell death：mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis，autophagy and senescence[J].FEBS J，2010，277(1)：2-21.

[23]Li T，Xu X H，Tang Z H，et al.Platycodin D induces apoptosis and triggers ERK-and JNK-mediated autophagy in human hepatocellular carcinoma BEL-7402 cells[J].Acta Pharmacol Sin，2015，36(12)：1503-1513.

(2015-10-12收稿)

Effects of LRP1 Knockdown on the TNF-α-induced Chondrocyte Injury in Rats

Yang Erping1，Peng Fei2，Liang Jie1etal

1DepartmentofOrthopedics，YichangFirstPeople’sHospital，ThreeGorgesUniversity，Yichang443000，China2DepartmentofOrthopedics，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060，China

Objective To examine the effect of low-density lipoprotein receptor-related protein 1(LRP1)on TNF-α-induced chondrocyte injuries in rats.MethodsLentivirus-packaged LRP1-shRNA was transfected into the primary chondrocytes to knock down the LRP1 gene.Three days after the transfection，chondrocytes were treated with the ERK inhibitor(PD098059)(10 μmol/L)or the P38 kinase inhibitor(SB203580)(10 μmol/L)for 30 min prior to the treatment of TNF-α(30 ng/mL)for 30 min.Total proteins were extracted for the detection of MAPKs pathway-related and apoptosis-related proteins by using Western blotting.The culture medium of chondrocytes treated with TNF-α for 12 h was collected for the detection of MMP13 levels by ELISA.ResultsThe expression levels of ERK，P38 and MMP-13 were significantly increased in chondrocytes in shLRP1 group as compared with those in control group after treatment with TNF-α.The expression levels of these proteins could be inhibited by PD098059 or SB203580(P<0.05).The expression levels of apoptosis proteins Caspase-3 and Bax were much increased and those of anti-apoptosis proteins p-Akt and Bcl-2 profoundly decreased in shLRP1 group as compared with those in control group(P<0.05).ConclusionThe knockdown of LRP1 can activate the MAPKs pathway，up-regulate the expression of MMP-13 and promote the apoptosis of chondrocytes treated with TNF-α.LRP1 is expected to become a therapeutic target for osteoarthritis.

osteoarthritis；chondrocytes；low-density lipoprotein receptor-related protein 1；MAPKs pathway；apoptosis；MMP-13；TNF-α

R681.3

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.004

*国家自然科学基金青年基金资助项目(No.61308110)

杨二平，男，1972年生，主治医师，E-mail：517078267@qq.com