DACH1对人肺腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的抑制作用*

余俊杰，　王建军，　翟　伟，　赵　亮，　吴　东

1华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院胸外科，武汉　4300142华中科技大学同济医学院附属协和医院胸外科，武汉　430022



论著

DACH1对人肺腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的抑制作用*

余俊杰1，2，王建军2，翟伟2△，赵亮1，吴东2

1华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院胸外科，武汉4300142华中科技大学同济医学院附属协和医院胸外科，武汉430022

目的研究DACH1在肺癌组织及配对癌旁组织中的表达情况，以及对人肺腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的作用。方法收集46例经病理学诊断为肺癌患者的组织标本，选取肿瘤组织并以配对癌旁组织为对照，应用实时荧光定量PCR检测肿瘤组织与配对癌旁组织标本中DACH1 mRNA表达情况；采用免疫组织化学法检测两组标本中DACH1蛋白的表达情况。使用siRNA干扰技术抑制人肺腺癌A549细胞系中DACH1的表达，采用MTT法观察其对肿瘤细胞增殖的影响，Transwell小室法观察肿瘤细胞侵袭的变化，采用流式细胞术检测对细胞系诱导凋亡的作用。结果实时荧光定量PCR测得DACH1 mRNA在肺癌组织中表达下降，免疫组织化学检测结果显示肺癌组织中DACH1蛋白表达明显降低，差异有统计学意义。siRNA干扰A549细胞DACH1的表达后，MTT法显示，si-DACH1组细胞增殖能力明显增强；Transwell小室法显示si-DACH1组细胞侵袭能力明显增强，流式细胞术显示，si-DACH1组细胞自发凋亡率明显降低。结论DACH1在肺腺癌组织中表达减少，在肺腺癌中起到抑癌基因的作用，并有望成为肺癌治疗的新靶点。

肺腺癌；DACH1；增殖；侵袭；凋亡

肺癌是人类常见的恶性肿瘤之一，近年来，其发病率呈逐步上升趋势，严重威胁人类的健康和生命[1]。尽管目前各种诊疗手段不断提高，但约80%临床确诊为肺癌的患者来医院就诊时就已经处于肿瘤晚期，有超过一半的患者已经存在远处转移而无法手术根治，或合并有不适合手术的疾病而无法接受手术[2]。即使接受手术根治、化疗、放疗以及个体化治疗，其中大部分也将最终发生肿瘤转移，远期生存率普遍较低。近年来，DACH1在肿瘤中的作用越来越受到关注，已经有研究证明在乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、肾透明细胞癌和胃癌中有DACH1表达的改变[3-4]。对于肺癌中是否存在DACH1 mRNA以及蛋白表达的改变值得研究。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

A549细胞(美国ATCC公司)、高糖DMEM培养液(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，美国Hyclone公司)、胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)、噻唑蓝(MTT，美国Amresco公司)、Transwell小室(美国Corning公司)、基质胶(Matrigel，美国BD公司)、Annexin Ⅴ-FITC/PI试剂盒(上海贝博公司)、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒(日本TaKaRa公司)、兔抗人DACH1多克隆抗体、HRP标记的二抗(美国Abcam公司)。

1.2标本收集

46例病例均来源于武汉协和医院胸外科2012年3月～2013年6月期间接受外科手术治疗的肺腺癌患者，所有患者术前均未接受化疗和(或)放疗等抗肿瘤治疗，所有患者术后均经病理证实为原发性肺腺癌，临床病理资料完整可靠。病理标本分别取自术中切除的新鲜肺癌组织和癌旁组织(距肿瘤边缘3 cm以内的肺组织)两部分配对，所有标本分两份，其中一份标本快速冰冻保存于-80℃冰箱中，直至用于实时荧光定量PCR检测mRNA水平；另一份标本经10%甲醛溶液固定后制作成蜡块，标准条件存放，此部分标本用于免疫组织化学法检测DACH1蛋白的表达。

1.3实时荧光定量PCR检测腺癌组织及癌旁组织DACH1 mRNA表达

提取RNA后行cDNA的合成，应用SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒行荧光定量PCR反应。DACH1上游引物序列：5′-CTTGTCAGAGGGAAGGGTGG-3′，下游引物序列：5′-GCACTGTTTGCCGCTTTACTT-3′；内参GAPDH上游引物序列：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物序列：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。反应体系为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火50 s，72°C延伸45 s，行40个循环。系统自动检测荧光，得出Ct(Cycle Threshold)值。

1.4免疫组织化学法检测腺癌组织及癌旁组织DACH1蛋白表达

组织固定及石蜡包埋后切片，血清封闭后一抗孵育，DACH1多克隆抗体浓度为1∶100，于4℃冰箱中保存过夜，二抗37℃孵育45 min后行DAB显色，复染脱水后封片，光学显微镜下观察拍照。

1.5siRNA技术干扰A549细胞DACH1的表达

DACH1基因siRNA表达载体由上海吉凯公司构建，设计DACH1正义序列链：5′-AAGGCCTCCTAAGAGGACTCA-3′，阴性对照正义序列链：5′-GACTTCATAAGGCGCATGC-3′。按照Lipofectamine 2000说明书转染细胞72 h后行Western blot及免疫荧光测siRNA干扰效果。

1.6Western blot及免疫荧光测siRNA干扰效果

分别将两组转染后细胞加入裂解液中进行研磨，超声后离心取上清进行蛋白定量，每组加样40 μg蛋白进行凝胶电泳，转至PVDF膜。脱脂牛奶封闭后一抗(1∶500)孵育过夜，HRP标记的二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，用ECL化学发光剂在凝胶成像分析系统进行成像及定量分析。

分别将两组转染后细胞进行爬片，多聚甲醛固定后，0.01%Triton X-100破膜，室温下1%胎牛血清封闭30 min，加一抗(1∶500)4℃孵育过夜；PBS洗3遍每次5 min；Cy3-羊抗兔二抗(1∶50)室温下暗盒中孵育2 h，DAPI染核后封片，荧光显微镜成像。

1.7MTT实验

转染72 h后将A549细胞以1.0×105/mL密度接种于96孔细胞培养板，每孔100 μL，分别于接种后1、2、3、4 d进行MTT检测。每孔加20 μL MTT(5 mg/mL)，混匀，37℃培养4 h，吸弃上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，紫外分光光度计490 nm波长测各孔吸光度(A)值，每孔设6个复孔。

1.8细胞侵袭实验

Matrigel稀释液(5 mg/L)包被Transwell小室的上室面，4℃干燥，PBS漂洗后放入预先加有600 μL含10%FBS的培养液内，随后在小室内加入100 μL A549细胞悬液，1.0×104/孔，37℃培养20 h后取出小室，棉签擦去上室面细胞后固定，0.1%结晶紫染色后显微镜下行细胞计数。

1.9Annexin Ⅴ-FITC/PI法检测凋亡率

用不含EDTA的胰酶消化细胞后离心收集细胞，冷PBS洗涤细胞2次，离心后用400μL Annexin Ⅴ结合液重悬细胞，细胞浓度为1×106/mL。加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC染色液，4℃避光孵育15 min，加入10 mL PI 4℃避光孵育5 min，用流式细胞仪检测。

1.10统计学分析

应用SPSS 14.0软件进行统计分析，两组数据均数的比较采用t检验进行分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1DACH1在肺癌组织与在癌旁组织中的表达

实时荧光定量PCR检测结果显示，46例癌组织中DACH1相对于GAPDH的ΔCt值为(6.18±0.42)，癌旁组织中其ΔCt值为(3.00±0.23)，计算2-ΔΔCt为0.43倍，即癌组织中DACH1基因mRNA含量为癌旁组织中的0.43倍，两者差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学结果显示，肺癌组织中IOD/area值为(0.067 1±0.005 8)，癌旁组织中IOD/area值为(0.151 2±0.012 8)，二者之间差异有统计学意义(P<0.05，图1)。该结果显示癌组织中DACH1 mRNA与蛋白表达均低于癌旁组织。

A：癌旁组织；　B：肺癌组织图1　肺癌组织与癌旁组织中DACH1的表达(免疫组织化学染色，×100)Fig.1 Expression of DACH1 in lung adenocarcinomas and the matched adjacent normal tissues(IHC Staining，×100)

2.2肺腺癌患者临床参数与DACH1 mRNA的关系

根据46例肺腺癌标本的mRNA检测结果，将患者以mRNA的中位数进行分类，23例为高表达，23例为低表达。分组结果显示DACH1与肿瘤大小及疾病分期存在关联，与吸烟状态及淋巴结转移无相关性(表1)。

表1　肺腺癌患者临床参数与DACH1 mRNA的关系

2.3siRNA干扰A549细胞DACH1表达

转染A549细胞72 h后，行免疫荧光检测DACH1的表达，结果显示si-DACH1组细胞的DACH1表达明显较对照组减少(图2A)；RT-PCR及Western bolt检测也显示si-DACH1组细胞的DACH1表达明显较对照组减少(图2B)。Western blot检测结果显示，对照组相对灰度值为(1.00±0.11)，si-DACH1组灰度值为(0.34±0.09)，si-DACH1组的DACH1表达明显较对照组减少。值得注意的是，在A549细胞中，DACH1在胞质及核内均有表达，胞质表达较核内明显，我们考虑与细胞系的差异性有关。

A：免疫荧光检测DACH1表达(×400);B：左RT-PCR检测DACH1 mRNA表达，右Western blot检测DACH1蛋白表达图2　si-DACH1抑制A549细胞DACH1的表达Fig.2 Inhibited DACH1 expression in A549 cells transfected with si-DACH1

2.4DACH1沉默对肺腺癌细胞增殖的影响

MTT结果显示，si-DACH1组A549细胞的增殖能力明显增强(图3)。在1、2、3、4 d，对照组的吸光度值分别为(0.34±0.04)、(0.47±0.05)、(0.78±0.07)、(1.33±0.06)，si-DACH1组的吸光度值分别为(0.35±0.06)、(0.62±0.05)、(1.07±0.07)、(1.84±0.06)，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。

2.5DACH1沉默对肺腺癌细胞侵袭能力的影响

A549细胞转染DACH1 siRNA 72 h后，通过Transwell小室侵袭实验比较两组细胞侵袭能力，结果显示si-DACH1组的侵袭细胞率为(65.2±1.5)%，明显高于对照组(28.2±1.1)%(P<0.05，图4)，提示DACH1 siRNA具有增强A549细胞侵袭的作用。

图3　两组细胞增殖能力的比较Fig.3 Comparison of the proliferation of A549 cells between the two groups

A：对照组；B：si-DACH1组图4　两组细胞侵袭能力的比较(×100)Fig.4 Comparison of the invasion of A549 cells between the two groups(×100)

2.6DACH1沉默对肺腺癌细胞凋亡的影响

两组细胞用Annexin Ⅴ-FITC/PI染色，经流式细胞仪检测发现，对照组细胞凋亡率为(3.84±0.52)%，si-DACH1组细胞凋亡率为(1.42±0.61)%，两组凋亡率差异具有统计学意义(P<0.05，图5)。表明DACH1的沉默可明显降低肺腺癌细胞的自发凋亡。

A：对照组B：si-DACH1组图5　两组细胞自发凋亡的比较Fig.5 Comparison of the spontaneous apoptosis of A549 cells between the two groups

3　讨论

DACH1是近年来发现的与多种肿瘤密切相关的抑癌基因之一，DACH1通过DS域参与相关信号通路，从而调节细胞的增殖和分化，其低表达提示预后不良。目前研究结果显示，DACH1在人乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌等肿瘤中表达降低，并与肿瘤类型、病理分期、淋巴结转移等密切相关[5-6]。

DACH1通过直接结合到细胞周期蛋白D1启动子区域并减少癌基因诱导的细胞周期蛋白D1的表达。在乳腺癌中，DACH1通过调节细胞周期和干细胞重组因子，起到抑制肿瘤的作用[7]。DACH1通过DS域直接作用于DACH1靶基因的启动子区域抑制Klf4、Nanog和Sox2的表达，阻碍乳腺肿瘤的生长并抑制干细胞增殖。DACH1也可抑制IL-8的表达和分泌从而抑制乳腺癌细胞的浸润和全身转移[7]。在前列腺癌中同样观察到DACH1水平的降低，DACH1增加AR活性而参与调控前列腺肿瘤的进展[8]。这些研究显示出DACH1的多种调控作用以及对细胞活性及肿瘤发生的影响。

通过全基因组测序显示，DACH1在非小细胞肺癌中表达明显降低，提示其在肺癌中同样存在抑癌作用的可能[9]。我们首先进行实时荧光定量PCR及免疫组化实验，检测结果显示DACH1在肺腺癌组织中表达水平明显降低，说明其可能参与肺癌的发生发展，其表达水平下降可能会失去对其他转录因子和靶基因的调控，从而失去对癌基因的转录抑制，肺癌细胞得以生长，也可能通过一个特定的细胞通路调节肿瘤抑制基因。我们应用siRNA干扰技术沉默A549细胞DACH1的表达后，观察到细胞增殖、侵袭明显增强，细胞自发凋亡率明显降低，说明DACH1的缺失可能导致细胞正常分化的失调，在肺癌的浸润转移过程中发挥一定作用。以上结果表明，DACH1基因在肺腺癌发生发展过程中可能具有重要的作用，并有望成为肺腺癌治疗的有效靶点，但具体调控机制还有待进一步研究。Han等[10]的研究显示，DACH1的表达与CXCL5呈负相关，并证明DACH1对肿瘤的抑制作用是通过抑制CXCL5信号通路来完成，这对我们今后的研究方向具有一定借鉴作用。

DACH1表达缺失的肺癌患者是否也存在较差的预后还需要继续临床随访观察。此外，在非小细胞肺癌中常常伴随着极度活跃的EGFR突变基因，果蝇中与DACH1同源的DAC基因有抑制EGFR的作用[11-12]，DACH1能否通过抑制EGFR的功能而阻止肿瘤的进展，目前未见文献报道，我们将在后续工作中进行深入研究。

[1]Ferro A，Peleteiro B，Malvezzi M，et al.Worldwide trends in gastric cancer mortality(1980-2011)，with predictions to 2015，and incidence by subtype[J].Eur J Cancer，2014，50(7)：1330-1344.

[2]Lyons G，Quadrelli S，Jordan P，et al.Clinical impact of the use of the revised International Association for the Study of Lung Cancer staging system to operable non-small-cell lung cancers[J].Lung Cancer，2011，74(2)：244-247.

[3]Popov V M，Wu K，Zhou J，et al.The Dachshund gene in development and hormone-responsive tumorigenesis[J].Trends Endocrinol Metab，2010，21(1)：41-49.

[4]Yan W，Wu K，Herman J G，et al.Epigenetic silencing of DACH1 induces the invasion and metastasis of gastric cancer by activating TGF-beta signalling[J].J Cell Mol Med，2014，18(12)：2499-2511.

[5]Wu K，Katiyar S，Li A，et al.Dachshund inhibits oncogene-induced breast cancer cellular migration and invasion through suppression of interleukin-8[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(19)：6924-6929.

[6]Wu K，Jiao X，Li Z，et al.Cell fate determination factor Dachshund reprograms breast cancer stem cell function[J].J Biol Chem，2011，286(3)：2132-2142.

[7]Wu K，Li A，Rao M，et al.DACH1 is a cell fate determination factor that inhibits cyclin D1 and breast tumor growth[J].Mol Cell Biol，2006，26(19)：7116-7129.

[8]Popov V M，Zhou J，Shirley L A，et al.The cell fate determination factor DACH1 is expressed in estrogen receptor-alpha-positive breast cancer and represses estrogen receptor-alpha signaling[J].Cancer Res，2009，69(14)：5752-5760.

[9]Govindan R，Ding L，Griffith M，et al.Genomic landscape of non-small cell lung cancer in smokers and never-smokers[J].Cell，2012，150(6)：1121-1134.

[10]Han N，Yuan X，Wu H，et al.DACH1 inhibits lung adenocarcinoma invasion and tumor growth by repressing CXCL5 signaling[J].Oncotarget，2015，6(8)：5877-5888.

[11]段楚骁，付圣灵，付向宁.CK516、P63、TTF-1和CK8/18在NSCLC组织中的表达及意义[J].华中科技大学学报：医学版，2015，44(2)：147-151,175.

[12]Mardon G，Solomon N M，Rubin G M.Dachshund encodes a nuclear protein required for normal eye and leg development in drosophila[J].Development，1994，120(12)：3473-3486.

(2016-03-11收稿)

DACH1 Suppresses the Proliferation，Invasion and Apoptosis of Human Lung Adenocarcinoma Cells

Yu Junjie1，2，Wang Jianjun2，Zhai Wei2△etal

1DepartmentofThoracicSurgery，WuhanCentralHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430014，China2DepartmentofThoracicSurgery，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China

ObjectiveTo examine the expression of DACH1 mRNA and protein in lung tumor tissues and their adjacent normal tissues and the role of DACH1 in the proliferation，invasion and apoptosis of lung adenocarcinoma cells.MethodsThe expression of DACH1 mRNA was detected by real-time fluorescent quantitative PCR in lung adenocarcinomas(n=46)and the matched adjacent normal tissues(n=46).Immunohistochemistry was used to detect the expression of DACH1 protein.Small-interfering(si)RNA was used to inhibit the expression of DACH1 in A549 cells.After down-regulation of DACH1 with siRNA，the proliferation of A549 cells was evaluated by MTT assay，the invasive ability of cells by using Transwell chamber assay，and the cell apoptosis by flow cytometry.ResultsReal-time fluorescent quantitative PCR and immunohistochemistry showed that the levels of DACH1 mRNA and protein were significantly decreased in lung adenocarcinomas as compared with those in normal tissues.Down-regulation of DACH1 by siRNA resulted in a significant increase in the proliferation and invasion of A549 cells.Flow cytometry revealed that the spontaneous apoptosis was significantly decreased in A549 cells with down-regulation of DACH1.ConclusionThe expression of DACH1 was profoundly decreased in lung adenocarcinomas，indicating that DACH1 may serve as a tumor suppressor gene in lung adenocarcinomas and it is expected to become a new therapeutic target for lung cancer.

lung adenocarcinoma；DACH1；proliferation；invasion；apoptosis

，Corresponding author，E-mail:zw111@aliyun.com

R734.2

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.001

*湖北省自然科学基金资助项目(No.2013CF088)

余俊杰，男，1988年生，住院医师，医学硕士，E-mail:hbsyyjj@163.com