杏仁核ERK在芬太尼诱导大鼠痛觉过敏中的作用及机制*

罗　琼，　尹平平，　罗　放

华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科，武汉　430030



杏仁核ERK在芬太尼诱导大鼠痛觉过敏中的作用及机制*

罗琼，尹平平，罗放△

华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科，武汉430030

目的探讨细胞外信号调节激酶(ERK)在芬太尼诱导痛觉过敏(OIH)中的作用及机制。方法雄性SD大鼠24只，随机分为正常组、OIH组、U0124组和U0126组。于右侧中央杏仁核(CeA)置管后，后3组皮下给予芬太尼制作OIH模型，成功后向CeA内分别注射0.3 μL 50% DMSO、1.5 nmol U0124(无药理活性的U0126结构类似物)和1.5 nmol U0126(ERK抑制剂)；正常组皮下给予等容量生理盐水，CeA内注射0.3 μL 50% DMSO。检测芬太尼或生理盐水注射前、注射后7 h及导管内给药0.5 h后机械缩足阈值和热缩足潜伏期，随后处死大鼠，取右侧中央杏仁核组织采用Western blot法检测p-ERK1/2的表达。另取雄性SD大鼠8只，随机分为OIH2组和正常2组，前者皮下注射芬太尼制作OIH模型，后者皮下注射生理盐水作为对照，制作脑片后记录各组右侧CeA区神经元U0126(10 μmol/L)使用前后的微小兴奋性突触后电流(mEPSCs)。结果与正常组比较，OIH组大鼠机械缩足阈值和热缩足潜伏期均降低(均P<0.05)，CeA区p-ERK2表达增加(P<0.05)，U0126，而非U0124，可翻转上述变化(均P<0.05)；脑片电生理记录示OIH2组mEPSCs幅值及频率均增加(均P<0.05)，且可被U0126逆转(P<0.05)。结论p-ERK2对OIH的形成至关重要，其机制可能与其增强杏仁核神经元间的突触传递有关。

细胞外信号调节激酶；杏仁核；突触可塑性；芬太尼；痛觉过敏

阿片类药物是治疗急、慢性疼痛的代表性药物，其副作用之一，阿片诱导的痛觉过敏(opioid-induced hyperalgesia，OIH)是临床亟待解决的问题。研究表明，中央杏仁核(CeA)不仅接受来自脊髓和脑干等多个部位的疼痛信息[1]，慢性疼痛状态下其自身突触传递还可发生可塑性变化。而细胞外信号调节激酶(ERK)是触发突触可塑性变化的重要介质[2]。因此，本研究选取CeA为研究部位，探讨ERK在阿片诱导的痛觉过敏中的作用及可能机制。

1　材料与方法

1.1实验动物

雄性SD大鼠，体重60～100 g，由华中科技大学同济医学院附属同济医院动物实验中心提供，室温饲养，自由摄食和饮水，光照与黑暗时间12 h∶12 h。

1.2实验分组

雄性SD大鼠24只，随机分为正常组、OIH组、U0124组和U0126组，共4组，均杏仁核CeA置管，恢复1周后，后3组分别皮下给予芬太尼制作OIH模型，成功后向CeA内分别注射0.3 μL 50% DMSO、1.5 nmol U0124和1.5 nmol U0126；正常组皮下给予等容量生理盐水，后向CeA内注射0.3 μL 50% DMSO。另取雄性SD大鼠8只，随机分为OIH2组和正常2组，前者给予芬太尼制作OIH模型，后者皮下注射生理盐水作为对照，在给予芬太尼，制作OIH模型成功后，利用全细胞脑片膜片钳技术分别记录各组CeA区神经元给予U0126(10 μmol/L)前后的微小兴奋性突触后电流(mEPSCs)。

1.3CeA区立体定位置管给药

立体定位置管给药装置购于中国深圳市瑞沃德生命科技有限公司。参照文献[3]的方法行立体定位置管，以10%的水合氯醛3 mL/kg腹膜腔注射麻醉大鼠，将其固定在立体定位仪(Stoelting公司，美国)上，消毒皮肤后，暴露颅骨前囟及矢状缝，在右侧CeA区(参考文献[4]坐标：前囟后2.2 mm，中线旁开4.2 mm，颅骨下7.8 mm)植入带管芯的套管，并用牙科骨水泥固定。手术后恢复1周再行后续实验。

1.4药物配制

U0124、U0126均购于美国Cayman chemical公司，药物的配制方法参照文献[5]。临用前溶于含50% DMSO的生理盐水中。

1.5OIH动物模型建立

枸橼酸芬太尼购于湖北省宜昌人福药业有限责任公司(批号：1130411)，临用前溶于0.9%的生理盐水中。采用文献[6]的方法建立OIH模型。在大鼠颈部皮下注射芬太尼，每次60 μg/kg，间隔15 min，共4次，累积药量240 μg/kg。对照组在大鼠颈部皮下注射等容量生理盐水。

1.6疼痛行为学检测

于芬太尼或生理盐水注射前(0 h)、注药后7 h(7 h)及导管内给药0.5 h后(给药0.5 h后)测机械缩足阈值和热缩足潜伏期。采用文献[7]的方法测左足机械缩足阈值，将大鼠静置于金属笼内30 min后，用不同压力的von Frey丝(North Coast公司，美国)垂直刺激鼠足掌面，力度以von Frey丝轻微弯曲为准，持续10 s或直至出现缩足反应。若出现缩足反应，记为阳性。采用up-and-down方法计算50%缩足反应阈值。采用热痛刺激仪(BME-410C，中国医学科学院生物工程研究所)测定热缩足潜伏期：将大鼠静置于底部为玻璃板的透明小室中，静置30 min后，辐射热对准大鼠左足掌正中照射，自动记录缩足反应的潜伏期作为热缩足潜伏期。截止时间为15 s，以免造成辐射损伤。

1.7中央杏仁核p-ERK表达的检测

痛阈测定完毕后立即处死大鼠，迅速取出右侧中央杏仁核组织冻存于-80℃备用。参照文献[8]用Western blot法检测中央杏仁核p-ERK的表达。将组织称重后加入适量的含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液(碧云天公司，中国)，匀浆后，12 000 g，4 ℃离心10 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度。加入SDS-PAGE上样缓冲液，95 ℃煮沸8～10 min使蛋白变性，制备SDS-PAGE凝胶(10%)，电泳后湿转至PVDF膜上。5%脱脂奶粉TBST缓冲液室温振荡封闭1 h后，加入封闭液稀释的单克隆抗体兔抗p-ERK(1∶2 000稀释，CST，美国)和小鼠抗GAPDH(1∶500，武汉博士德生物工程有限公司)，4 ℃孵育过夜，洗膜，加入TBST稀释的HRP-山羊抗兔和HRP-山羊抗小鼠的二抗(1∶10 000，武汉博士德生物工程有限公司)，室温孵育2 h，洗膜后在避光条件下将ECL试剂盒中的A、B两种试剂等体积混合，振荡混匀后均匀加到膜上，用化学发光凝胶图像系统拍照。p-ERK1/2表达以p-ERK1/2吸光度值与GAPDH吸光度值的比值表示。

1.8全细胞膜片钳记录

用振动切片机(LEICA VT1000S)将取自OIH2组和正常2组含有CeA区的右脑组织块冠状切成厚度为350 μm的脑片。切片溶液为4℃，溶液组成为(mmol/L)：213蔗糖，3 KCl，1 NaH2PO4，0.5 CaCl2，5 MgCl2，26 NaHCO3和10葡萄糖，将所得脑片在人工脑脊液(ACSF)中25 ℃孵育至少1 h，ACSF组成为(mmol/L)：125 NaCl，5 KCl，1.2 NaH2PO4，2.6 CaCl2，1.3 MgCl2，26 NaHCO3和10葡萄糖。切片液及脑脊液在使用时均为氧饱和溶液，且pH=7.2～7.4，渗透压为290～310 mOsm/L。在持续灌流ACSF，温度控制在31℃，前置电压为-70 mV条件下记录mEPSCs。膜片钳放大器为HEKA EPC-10(Molecular Devices)，记录软件为patchmaster(Molecular Devices)，应用红外线微分干涉相差显微镜在可视化模式下记录CeA区神经元mEPSCs。记录电极为玻璃微电极(WPI)，电极内液组成为(mmol/L)：145 KCl，5 NaCl，10 HEPES，5 EGTA，4 Mg-ATP，0.3 Na3-GTP。

1.9统计学方法

2　结果

2.1杏仁核注射U0126可治疗芬太尼诱导的痛觉过敏

与正常组相比，OIH组机械缩足阈值和热缩足潜伏期降低(均P<0.05)，CeA区给予U0126(而非U0124)可翻转OIH组所致的上述改变(均P<0.05)(表1)。

表1　各组不同时间点机械痛和热痛对比±s)

与正常组比较，aP<0.05；与OIH组比较，bP<0.05

2.2U0126可阻断芬太尼诱导的杏仁核p-ERK2过度表达

与正常组比较，OIH组和U0124组大鼠中央杏仁核p-ERK2表达上调(均P<0.05)，UO126组p-ERK2表达差异无统计学意义(P>0.05)；与OIH组比较，U0126组p-ERK2表达下调(P<0.05)，U0124组p-ERK2表达差异无统计学意义(P>0.05)；各组p-ERK1表达差异均无统计学意义(均P>0.05)(图1)。

A：Western blot检测；B：p-ERK1/2相对吸光度；与正常组比较，*P<0.05图1　各组CeA区p-ERK1/2表达的比较Fig.1 Comparison of p-ERK1/2 expression in CeA area between groups

2.3U0126对OIH大鼠杏仁核突触传递的影响

与正常2组相比，OIH2组脑片全细胞膜片钳记录的mEPSCs的电流幅值及频率均增加(均P<0.05)，但可被U0126逆转(均P<0.05)，U0126对正常2组大鼠的mEPSCs无影响(图2)。

A：20 s mEPSCs典型记录；B，C：mEPSCs的幅值和频率统计图；*P<0.05图2　ERK抑制剂U0126对CeA区神经元mEPSCs的影响Fig.2 Effect of the ERK inhibitor U0126 on mEPSCs in CeA neurons

3　讨论

本研究采用行为学测试、Western blot和脑片电生理技术探讨杏仁核中ERK在OIH中的作用及机制。结果证明，给大鼠重复注射芬太尼后可诱导典型的痛觉过敏，这种痛觉过敏可被CeA区注射的ERK的抑制剂U0126逆转，Western blot检测证实OIH痛觉过敏与CeA区p-ERK2激活相关，为了进一步探究ERK引起痛觉过敏的机制，研究采用脑片电生理技术记录CeA区神经元的mEPSCs，结果发现OIH时mEPSCs的电流幅值和频率均增加，且能被急性给予的U0126逆转。

杏仁核因其在疼痛调制中的重要作用，已被部分学者称为“伤害性杏仁核”[9]，Schweinhardt等[10]研究表明，伤害性疼痛信息经过CeA可上行传导至前额皮质(PFC)和前扣带回皮质(ACC)等脑区，下行经中脑导水管周围灰质(PAG)，延髓头端腹内侧部(RVM)传至脊髓背角调制伤害性疼痛的防御反应。Carrasquillo等[11]的研究发现杏仁核ERK1和ERK2都参与调制甲醛溶液诱发的炎性痛大鼠的机械痛，但不影响热痛[5]。本实验结果显示，杏仁核p-ERK2而不是ERK1参与了阿片诱发的机械痛和热痛的痛觉过敏的维持，且抑制杏仁核ERK活化可逆转OIH。

Ren等[12]认为mEPSCs的频率反映突触前膜递质释放概率，而mEPSCs的幅值反映作用于突触后膜的神经递质量子化释放的多少。本研究中，OIH时，mEPSCs的频率和幅值均增加，表明，OIH时，杏仁核神经元的突触前膜神经递质释放概率可能增大，且突触后膜的神经递质量子化释放可能增加，由此导致杏仁核神经元的突触传递功能增强，杏仁核神经元可能发生了功能上的突触可塑性。而在给予ERK抑制剂U0126后，mEPSCs的频率和幅值均降至正常，而U0126不影响对照组的mEPSCs。由此，我们可以推断，OIH时，杏仁核神经元的突触传递功能增强与ERK的活化有关，这可能是ERK调制阿片诱发的痛觉过敏的作用机制之一。Woolf等[13]总结了大量的研究结果发现，NMDA受体在伤害性疼痛的中枢敏化诱导中具有重要作用，值得注意的是，伤害性刺激诱导的NR1亚基的磷酸化需要ERK的参与，同时ERK还与脊髓Ⅱ层神经元缓激肽诱导的NMDA电流的增强及AMPA的功能依赖性位点的激活有关。我们的研究结果也证实ERK参与调节OIH大鼠杏仁核突触可塑性，但本研究中，ERK是否通过NMDA受体或AMPA受体增强OIH大鼠杏仁核的神经元突触传递功能，尚待进一步探究。

综上所述，杏仁核ERK对OIH的形成至关重要，其机制可能与其增强神经元间的突触传递有关。

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(2016-02-22收稿)

Role of Amygdala ERK in Fentanyl-induced Hyperalgesia in Rats

Luo Qiong，Yin Pingping，Luo Fang△

DepartmentofAnesthesiology，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

ObjectiveTo explore the role of extracellular signal-regulated kinase(ERK)in amygdala in fentanyl-induced hyperalgesia and the possible mechanism.MethodsA total of 24 healthy male Sprague-Dawley rats，weighing 60—100 g，were implanted with a cannula in the right central nucleus of amygdala(CeA)，and divided into 4 groups：normal group，opioid-induced hyperalgesia(OIH)group，U0124 group and U0126 group.Rats in the latter three groups were subcutaneously injected with fentanyl to induce OIH according to a standard protocol，then injected via the cannula with 50% DMSO in OIH group，1.5 nmol U0124(an negative structural control analog of U0126)in U0124 group，and 1.5 nmol U0126(an ERK inhibitor)in U0126 group.Animals in the normal group were subcutaneously injected with saline，and then administered 0.3 μL of 50% DMSO through the cannula.The mechanical paw withdrawal threshold(PWT)and thermal paw withdrawal latency(PWL)were tested before OIH induction，7 h after fentanyl or saline injection and 0.5 h after CeA drug administration.After the last measurement of pain threshold，the rats were sacrificed，and right CeA tissues were sampled for detection of the expression of phosphorylated ERK1/2(p-ERK1/2)by Western blotting.Another 8 SD male rats were obtained and randomly divided into OIH2group and normal2group.Rats in OIH2group were induced to develop OIH with fentanyl and those in the normal2group were injected with saline as control group.Whole cell voltage-clamp recordings were conducted to detect miniature excitatory postsynaptic currents(mEPSCs)from visually identified right CeA neurons before and after the use of U0126 in brain slices with DIC-IR videomicroscopy.ResultsPWT and PWL were sharply decreased，and the expression of p-ERK2 in CeA was significantly increased in OIH group as compared with those in normal group(P<0.05).Intra-CeA injection of U0126，but not U0124，reversed both behaviors of hyperalgesia and molecular change of ERK(P<0.05).Both the frequency and amplitude of mEPSCs recorded on CeA neurons were significantly increased in OIH2group when compared with those in normal2group(P<0.05)，which were completely reversed by administration of U0126(P<0.05).Conclusionp-ERK2 may play a key role in the development of fentanyl-induced hyperalgesia by increasing the synaptic transmission in amygdala.

extracellular signal-regulated kinase；amygdala；synaptic plasticity；fentanyl；hyperalgesia

，Corresponding author，E-mail:1185045627@qq.com

R741.041

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.003

*国家自然科学基金资助项目(No.81271234)

罗琼，女，1986年生，医学硕士，E-mail:rojoan198617@163.com，现址:武汉大学中南医院麻醉科，武汉 430071