缬芎滴丸对大鼠脑缺血半暗带组织Nestin、DCX、NeuN表达的影响*

干良敏，　魏守蓉△，　王　文，　刘婷婷，　魏仁平，　薛存宽

1华中科技大学同济医学院附属梨园医院急诊科，武汉　4300772首都医科大学宣武医院动物室，北京　1000533河北北方学院药理系，张家口　075000



缬芎滴丸对大鼠脑缺血半暗带组织Nestin、DCX、NeuN表达的影响*

干良敏1，魏守蓉1△，王文2，刘婷婷2，魏仁平3，薛存宽1

1华中科技大学同济医学院附属梨园医院急诊科，武汉4300772首都医科大学宣武医院动物室，北京1000533河北北方学院药理系，张家口075000

目的探讨中药复方缬芎滴丸对大鼠脑缺血半暗带组织神经巢蛋白(Nestin)、双肾上腺皮质激素(DCX)、神经核蛋白(NeuN)表达的影响。方法SD大鼠随机分为假手术组、模型组、缬芎滴丸(50 mg/kg)给药组，线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞模型(MCAO)，缺血30 min再灌注，假手术组大鼠只结扎颈总动脉，不插栓。造模成功后对缬芎滴丸组大鼠灌胃给药，假手术组和模型组给予等量的蒸馏水。给药7 d后采用免疫荧光染色技术观察缬芎滴丸对大鼠脑缺血半暗带组织Nestin、DCX、NeuN表达的影响。结果大鼠脑缺血半暗带组织Nestin表达量在假手术组为(18.67±0.58)，模型组为(49.00±5.29)，缬芎滴丸组为(105.67±3.51)，给药组和模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)；DCX表达量在假手术组为(21.67±1.53)，模型组为(61.00±4.36)，缬芎滴丸组为(112.00±12.53)，给药组和模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)；NeuN表达量在假手术组为(28.67±6.51)，模型组为(46.00±4.36)，缬芎滴丸组为(323.00±10.82)，给药组和模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论缬芎滴丸可能通过促进大鼠脑缺血半暗带组织Nestin、DCX、NeuN表达，上调内源性神经发生，从而参与脑组织损伤修复过程。

脑缺血半暗带；缬芎滴丸；神经巢蛋白；双肾上腺皮质激素；神经核蛋白

脑血管疾病具有高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率的特点，给患者和家庭带来无尽痛苦，其中70%～80%为缺血性脑血管病。目前缺血性脑血管病的治疗方法主要有溶栓治疗[1]、神经保护治疗[2]以及两者的联合治疗[3]，虽然这些治疗方法在一定程度上取得了较好的效果，但对于大多数脑梗死患者而言，神经细胞死亡不可避免，如何有效促进脑缺血后神经细胞再生仍然是国内外学者研究的重点。复方缬芎滴丸是同济医学院老年病研究所受湖北龙人制药集团公司委托研制，为精制缬草油、缬草和川芎的浸提物，前期实验发现复方缬芎滴丸对急性脑缺血有明显的防治作用[4]，但其在神经发生方面的作用机制国内外尚未见报道，因此本文在原来实验基础上，通过检测缬芎滴丸对大鼠脑缺血半暗带组织神经巢蛋白(Nestin)、双肾上腺皮质激素(DCX)、神经核蛋白(NeuN)表达的影响，来探讨缬芎滴丸是否能促进大鼠脑缺血后神经发生，从而减轻大鼠脑缺血半暗带组织损伤，改善脑神经功能。

1　材料与方法

1.1实验药物

复方缬芎滴丸实验药液的配制：以复方缬芎滴丸的原料药——精制缬草油、缬草和川芎浸提物，加2倍重量的Tween-80、1，2-丙二醇混合物助溶，用蒸馏水稀释配制成50 mg/mL的药物原液。

1.2主要试剂与仪器

Nestin购自上海艾博抗贸易有限公司，批号：ab92391；DCX购自上海赛信通生物试剂有限公司，批号：#4604s；NeuN购自上海艾博抗贸易有限公司，批号：ab177487；山羊抗兔二抗(IF-488)购自北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZF-0511；山羊抗兔二抗(IF-594)购自北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZF-0516；冰冻切片机购自美国Thermo Fisher公司；染色用普通光学显微镜、观察拍照用显微镜均购自日本Olympus公司；线栓(2634-100，d=0.26 mm)购自北京沙东生物技术有限公司；大鼠手术操作台、无影灯及造模器械由首都医科大学宣武医院实验动物室提供。造模手术器械主要有眼科剪、止血钳、动脉夹、眼科镊、缝合针、缝合线、持针器、培养皿等。

1.3实验动物分组及给药

27只SPF级雄性SD大鼠，2～3个月龄，体重260～280 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号：SCXK(京)2007-0001。随机分为：假手术组、模型组、缬芎滴丸(50 mg/kg)给药组，每组9只。MCAO手术造模，大鼠清醒后立即对缬芎滴丸(50 mg/kg)组大鼠灌胃给药，每次2 mL/只，每天1次，连续7 d，每次在同一时间点给药，假手术组和模型组给予等量的蒸馏水。

1.4模型制备及模型成功评价标准

对Zea Longa改良线栓法[5]略加改进制备局灶性脑缺血再灌注模型。大鼠用10%水合氯醛(0.35 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定于鼠板上，颈部正中切口，钝性分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，永久结扎颈外动脉和颈总动脉的近心端，动脉夹临时夹闭颈内动脉，在动脉夹与颈总动脉近心端之间结扎一道缝合线，不扎紧。颈总动脉接近颈外动脉和颈内动脉分叉处用眼科剪作一斜行细切口，将顶端涂有硅胶形成光滑球面的直径为0.26 mm的线栓插入，稍扎紧缝合线，松开动脉夹，推动线栓进入颈内动脉。当线栓插入约0.8 cm接近颈总动脉分叉处时注意调整线栓方向，避免误入翼腭动脉，线栓插入约1.8 cm时注意放慢插栓速度，插线遇阻力时停止插线动作，此时MCAO模型制成。记录栓塞开始时间，结扎颈总动脉远心端以固定栓线。缝合肌肉、皮肤。栓塞30 min后拔出线栓。假手术组大鼠除不插入线栓外，其他操作与手术组相同。大鼠造模清醒后进行神经功能评分，模型成功及评价标准参照Longa[5](4分)、Bederson[6](3分)、平衡木实验(5分)、视觉亚实验(2分)、触觉亚实验(2分)和本体觉亚实验(2分)共18分改良神经功能评分(modified neurological severity score，mNSS)法。剔除小于7分和大于13分者，并随机补充各组设计所需大鼠数量。

1.5实验方法与观察指标

1.5.1大鼠灌注取脑大鼠10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定于灌注台上，沿肋弓下向左右至两侧腋中线剪开皮肤、皮下组织及膈肌，翻起胸壁，使心脏充分暴露，持灌注针从左心室心尖处进入，直至针头到达主动脉起始处，血管钳固定灌注针，针尾连接装满生理盐水的针筒，用眼科剪在右心耳处剪一小口，推注生理盐水，速度先快后慢，至大鼠肺、肝脏、四肢末端变白时，将生理盐水换成多聚甲醛固定液。推固定液时可发现大鼠先是剧烈抽动，推注完毕后，大鼠四肢绷直，尾部竖起，肢体苍白而僵硬，这些为大鼠灌注成功的标志。剪开大鼠头顶部皮肤和筋膜，分离颅骨，用弯镊取出脑组织。取出的脑组织置于配好的后固定液中，并放入4℃冰箱保存。开始时脑组织浮于后固定液表面，约1周后脑组织沉底，此时更换后固定液，再放置约48 h后，脑组织即可用于冰冻切片。

1.5.2冰冻切片将固定好的大鼠脑组织取出，用刀片将小脑及嗅球部分切除，放入装有异戊烷的离心管，置于液氮中速冻10 s后用于冰冻切片。冰冻切片设定厚度20 μm，切好的脑片转移至装有0.01 mol/L PBS的6孔板中，4℃冰箱保存。

1.5.3免疫荧光染色(Nestin、DCX、NeuN)脑片破膜30 min，羊血清封闭2 h后，分别加入兔抗Nestin/DCX/NeuN(1∶200)，4℃冰箱过夜；第2天加荧光二抗(1∶200)，室温孵育2 h；含DAPI封片剂封片；正置荧光显微镜观察拍照：每只动物选取3张切片，每张切片选取相同部位皮质梗死半暗带，在100倍镜下拍照，选取Nestin/DCX/NeuN染色阳性的细胞，计算每个视野下阳性细胞数量。以上实验均重复3次。

1.6统计学方法

2　结果

2.1缬芎滴丸对大鼠脑缺血半暗带组织Nestin表达的影响

假手术组可见少量Nestin蛋白表达，表达量为(18.67±0.58)；模型组Nestin蛋白表达量为(49.00±5.29)，较假手术组升高，表达部位主要位于脑梗死周边区域；缬芎滴丸给药组大鼠脑梗死周边区域Nestin蛋白表达量为(105.67±3.51)，和模型组比较明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，结果见图1。

2.2缬芎滴丸对大鼠脑缺血半暗带组织DCX表达的影响

假手术组可见少量DCX蛋白表达，表达量为(21.67±1.53)；模型组DCX蛋白表达量为(61.00±4.36)，较假手术组升高，表达部位主要位于脑梗死周边区域；缬芎滴丸给药组大鼠脑梗死周边区域DCX蛋白表达量为(112.00±12.53)，和模型组比较明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，结果见图2。

A：假手术组；B：模型组；C：缬芎滴丸(50 mg/kg)给药组图1　缬芎滴丸对大鼠脑缺血半暗带组织Nestin表达的影响(免疫荧光染色，×100)Fig.1 Effect of valerian ligusticum pill on the expression of Nestin in the cerebral ischemic penumbra of rats(immunofluorescent staining，×100)

A：假手术组；B：模型组；C：缬芎滴丸(50 mg/kg)给药组图2　缬芎滴丸对大鼠脑缺血半暗带组织DCX表达的影响(免疫荧光染色，×100)Fig.2 Effect of valerian ligusticum pill on the expression of DCX in the cerebral ischemic penumbra of rats(immunofluorescent staining，×100)

2.3缬芎滴丸对大鼠脑缺血半暗带组织NeuN表达的影响

假手术组可见少量NeuN蛋白表达，表达量为(28.67±6.51)；模型组NeuN蛋白表达量为(46.00±4.36)，较假手术组升高，表达部位主要位于脑梗死周边区域；缬芎滴丸给药组大鼠脑梗死周边区域NeuN蛋白表达量为(323.00±10.82)，和模型组比较明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，结果见图3。

A：假手术组；B：模型组；C：缬芎滴丸(50 mg/kg)给药组图3　缬芎滴丸对大鼠脑缺血半暗带组织NeuN表达的影响(免疫荧光染色，×100)Fig.3 Effect of valerian ligusticum pill on the expression of NeuN in the cerebral ischemic penumbra of rats(immunofluorescent staining，×100)

3　讨论

一个多世纪以前，国内外学者普遍认为成年哺乳动物中枢神经系统不可再生，近些年的研究逐渐打破了这一传统认识：1965年Altman等[7]采用3H胸腺嘧啶标记技术，在大鼠第三脑室、侧脑室室管膜下层观察到一些处于有丝分裂期的神经元和成神经细胞；1992年Reynolds和Richards等[8-9]相继从成年小鼠脑组织中分离出具有增殖分化能力的神经干细胞；2010年，Marti-Fabregas等[10]报道了脑缺血可以刺激人脑室管膜下区(SVZ)产生大量具有增殖和迁移能力的神经干细胞。虽然研究表明脑缺血可以刺激内源性神经干细胞增殖分化并迁移到缺血半暗带区域，但这种自我修复能力有限，不足以改善脑缺血后神经功能[11]，因此寻找促进内源性神经发生的治疗方法成为脑神经损伤后修复的关键。

神经组织在结构和功能上与中医络脉相似，可将其归属为络脉范畴，古人认为络脉产生的物质基础是脑髓，脑髓的生成和发育与五脏六腑皆有关，与肝、肾关系尤为密切，因此肝、肾对维持脑内神经元的相对恒定、抗损伤修复至关重要[12]。而且，缺血性脑血管病的病因为血流部分或完全中断，符合中医机理之瘀血；结局为神经元死亡，符合中医机理之络损，因此活血化瘀和通络止痛的药物是目前中医药神经保护和再生研究的热点[13]。缬芎滴丸的主要成分为缬草和川芎，缬草性辛、甘、温，归心、肝经，有养心安神、理气通络、活血止痛的功效；川芎辛散温通，归肝、胆、心包经，具有活血行气、祛风止痛的功效，其药理机制为我们研究缬芎滴丸的促神经发生作用提供了重要启示。

实验结果显示，缬芎滴丸可有效促进大鼠脑缺血半暗带组织Nestin、DCX、NeuN表达。Nestin是神经干细胞的特异性标记蛋白，与神经元增殖有关，在神经干细胞鉴定中被广泛应用[14]，图1结果中缬芎滴丸给药组大鼠脑缺血半暗带Nestin表达量明显高于假手术组和模型组，说明缬芎滴丸有助于大鼠脑缺血后神经干细胞的增殖。此后我们开始思考这些增殖期神经细胞的来源，于是对DCX在大鼠脑缺血半暗带的表达进行检测，DCX是一种微管相关蛋白，主要在成神经细胞和未成熟神经元中表达，在细胞迁移的过程中起重要的作用[15-16]。图2结果中缬芎滴丸组大鼠脑缺血半暗带DCX表达量明显高于假手术组和模型组，表明这些增殖期神经细胞是从损伤部位以外的地方迁移来的，缬芎滴丸可能参与了神经干细胞从存在的主要脑区迁移到脑缺血半暗带的过程，这一结果与目前公认的成年哺乳动物神经干细胞存在的主要脑区为侧脑室外侧壁室管膜下区(SVZ)和海马齿状回颗粒下层(SGL)相符。接着我们进一步思考这些迁移来的增殖期神经细胞在半暗带的转归，因此继续检测了脑缺血半暗带NeuN的表达情况，NeuN是成熟神经元细胞核的特异性标记物，它的出现与发育中的神经元退出细胞周期或是处于分化终末期有关[17]，图3结果显示了缬芎滴丸促大鼠脑梗死半暗带NeuN蛋白表达的作用。

实验结果表明，脑缺血后给予缬芎滴丸药物治疗可上调成年哺乳动物脑内神经发生，诱导内源性神经前体细胞分裂、增殖并向损伤区域迁移，进而分化为成熟的神经细胞。但这些新生神经元是否能完全替代缺血坏死的神经细胞，恢复原有神经功能还不得而知。而且神经发生的机制非常复杂，涉及多种神经生长因子和信号通路，这个实验并未进一步探究缬芎滴丸促神经发生的具体机制，因此我们有必要对神经发生及缬芎滴丸促神经发生的具体机制做深入的研究，充分发挥神经中枢内源性修复作用，为治疗缺血性脑血管疾病开辟新的途径。

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(2016-05-11收稿)

Effects of Valerian Ligusticum Pill on the Expression of Nestin，DCX，NeuN in Cerebral Ischemic Penumbra of Rats

Gan Liangmin1，Wei Shourong1△，Wang Wen2etal

1DepartmentofEmergency，LiyuanHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430077，China2AnimalLaboratory，XuanwuHospitalofCapitalMedicalUniversity，Beijing100053，China

ObjectiveTo investigate the effects of valerian ligusticum pill on the expression of Nestin，DCX，NeuN in the cerebral ischemic penumbra of rats.MethodsSD rats were randomly divided into sham-operated group，model group，and valerian ligusticum pill(50 mg/kg)group.The animal model was established by occlusion of the middle cerebral artery with suture embolus method，and then reperfusion after 30-min ischemia.Rats in the sham-operated group only underwent the ligation of the common carotid artery，with no embolus plugged.After the success of the model establishment，rats in valerian ligusticum pill group were intragastrically given valerian ligusticum pill(50 mg/kg)for 7 days，while an equal amount of distilled water was given to rats in the sham-operated group and model group.The expression levels of Nestin，DCX and NeuN were detected in the cerebral ischemic penumbra of rats by immunofluorescent staining.ResultsThe expression levels of Nestin were(18.67±0.58)，(49.00±5.29)，and(105.67±3.51) in sham-operated group，model group and valerian ligusticum pill group，respectively，with significant difference found between the valerian ligusticum pill group and the model group(P<0.01).The expression levels of DCX were(21.67±1.53)，(61.00±4.36)，and(112.00±12.53) in sham-operated group，model group，and valerian ligusticum pill group，respectively.The expression levels of NeuN were(28.67±6.51)，(46.00±4.36)，and(323.00±10.82) in sham-operated group，model group and valerian ligusticum pill group，respectively.There were significant differences in the expression of DCX and NeuN between the valerian ligusticum pill group and model group(P<0.01).ConclusionValerian ligusticum pill may participate in the repair process of brain tissue injury by inducing the expression of Nestin，DCX and NeuN and promoting the neurogenesis in the cerebral ischemic penumbra.

cerebral ischemic penumbra；valerian ligusticum pill；Nestin；DCX；NeuN

，Corresponding author，E-mail：13329718902@163.com

R743.32

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.002

*湖北省自然科学基金资助项目(No.2014CBF957)

干良敏，女，1988年生，硕士研究生，E-mail：1325174425@qq.com