金银花水煎液抗流感病毒作用的研究※

朱明珠　毛淑敏　刘玉红王立娜陈田雨秦乐邢佰颖

（山东中医药大学药学院，济南250355）

金银花水煎液抗流感病毒作用的研究※

朱明珠毛淑敏刘玉红*王立娜陈田雨秦乐邢佰颖

（山东中医药大学药学院，济南250355）

目的探究金银花水煎液对小鼠体内抗流感病毒的作用效果。方法将小鼠随机分成四组，每组12只小鼠，包括正常组、模型组、水煎液组、利巴韦林组。鼻腔接种甲型H1N1流感病毒制备小鼠病毒模型，检测肛温，胸腺、脾脏、肺指数，血清IFN-γ含量，计算死亡率。结果金银花水煎液可以提高病毒小鼠的胸腺、脾脏、肺指数抑制率，增加血清IFN-γ含量，降低肺指数，有助于肛温回升，降低死亡率。结论金银花水煎液对小鼠体内抗流感病毒的作用效果显著。

流感病毒；金银花水煎液；实验研究

流行性感冒（inf1uenza，简称流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，具有传染性强、发病率高、流行面广及死亡率高等特点，是人类至今尚不能有效控制的世界性传染病。据统计，流感每年的发病率为10%～30%，全球每年约有50万人死于流感，主要死于呼吸系统的并发症，特别是重症肺炎和呼吸窘迫综合征［1］。因此，重症流感的治疗仍是临床的重点和难点，急需有效的药物进行治疗。金银花为常用传统中药，具清热解毒、凉散风热之功，临床上广泛用于治疗上呼吸道病毒感染，疗效显著。为进一步确定金银花的抗流感病毒作用，为其临床应用提供实验依据，建立甲型H1N1流感病毒感染小鼠模型，研究金银花水煎液的体内抗流感病毒作用。

1　材料与方法

1.1实验材料

1.1.1仪器EL340i型全自动酶标仪（Mo1ecu1ar De-vices）；AL204电子天平（精密度：0.0001g，梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司）；RE-52型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；LGJ-18A冷冻干燥机（北京四环科学仪器厂）；CT15RT型台式高速冷冻离心机（上海天美生化仪器设备工程有限公司）。

1.1.2试药甲型H1N1流感病毒鼠肺病毒毒株FM1；金银花购自山东平邑，经山东中医药大学生药系李佳教授鉴定为忍冬科植物忍冬Lonicera jaPonica Thumb.的带初开的花或干燥花蕾；利巴韦林颗粒（湖南千金湘江药业股份有限公司）；干扰素-γ（IFN-γ）（北京四正柏生物科技有限公司）；生理盐水。

1.1.3实验动物昆明小鼠，体重（20±2）g，洁净级，雌雄小鼠各半，来自山东鲁抗医药股份有限公司实验动物中心。

1.2实验方法

12.1试药制备取金银花药材100g，加入30倍量的水，85℃提取3次，90min/次，过滤，60℃减压浓缩，冻干，得黄色粉末，即水煎液样品。

1.2.2实验小鼠造模与分组昆明小鼠48只，随机分成4组，分别为正常组、模型组、水煎液组（300mg/kg）、利巴韦林组（58.5mg/kg，相当于人临床等效剂量），饲养2天后开始接种病毒。第0天为接种病毒前，第1天为接种流感病毒，正常组鼻腔滴注生理盐水，其余各组小鼠滴鼻接种50μL流感病毒，24小时后灌胃给药，第2～8天为药物干预治疗，正常组和模型组以10m1/kg的体积灌喂蒸馏水，水煎液组灌喂同体积的金银花水煎液，利巴韦林组灌胃同体积的利巴韦林，连续给药8天。逐日观察各组小鼠感染病毒后全身的反应，包括进食量、呼吸、活动状态等，记录小鼠每天的肛温、体重和死亡情况。

1.2.3肺部病变程度的测定小鼠病毒感染后第9天，处死小鼠，称其质量，取出全肺，用生理盐水洗净，剥离结缔组织、表面脂肪，观察并记录肺组织外观情况。对小鼠肺的病变程度进行分级。无病变记为0，病变面积在全肺的1/4以下记为1，病变面积占全肺的1～4/1～2记为2，病变面积占全肺的1～2/3～4记为3，病变面积占全肺的3～4/4～5记为4；病变面积几乎占肺的全部记为5，计算肺病变减轻率［2］。

1.2.4肺指数与肺指数抑制率的测定用干净滤纸吸掉肺组织周围水分，称肺重，计算肺指数和肺指数抑制率［3］。

1.2.5脾脏、胸腺指数的测定

1.2.6小鼠血清IFN-γ的测定末次给药24小时后，摘眼球取血于离心管内，静置30min，于低温高速离心机中离心15min，4000r/min，收集血清，-70℃保存备用。采用酶联免疫吸附试验法（ELISA）进行检测，测定血清IFN-γ含量，严格按照试剂盒操作说明进行［4］。

2　实验结果

2.1小鼠形态观察模型组小鼠感染病毒2天后逐渐饮食减少，毛松易脱落，嗜睡，畏寒发抖；正常组小鼠皮毛干爽有光泽，喜动不喜卧，精神状态良好，对外界环境反应敏捷。

2.2小鼠肛温变化

表1　小鼠肛温变化（℃）

图1　小鼠肛温变化

结果见表1和图1，各组小鼠前期肛温无明显变化；模型组与正常组比较，接种病毒后，小鼠肛温明显降低（P<0.05），表明造模成功；水煎液组与模型组比较，小鼠感染病毒降温后出现体温的回升，而且，可以看出金银花水煎液回温效果和利巴韦林水平相近，表明金银花水煎液对抗流感病毒有一定的疗效。

2.3肺组织外观观察

图2　各组小鼠肺组织观察

结果见图2，经肉眼观察，正常组小鼠肺组织颜色粉红，表面比较光滑，无病变区；模型组小鼠肺组织颜色为暗褐色，水肿充血严重，存在病变区；利巴韦林组、水煎液组与模型组比较，均出现不同程度症状减轻。

2.4小鼠肺部病变程度

表2　小鼠肺部病变程度级别及减轻率［只（%）］

结果见表3，正常组死亡率为0%，模型组死亡率高达41.67%，与模型组比较，水煎液组和利巴韦林组可以降低病毒感染小鼠的死亡率。小鼠感染流感病毒后引发肺炎，肺部肿胀，肺指数相应增加。所以，肺指数可作为指标，用于评价药物是否具有抗流感病毒作用。模型组较正常组肺指数明显增加，说明小鼠感染病毒成功；利巴韦林组肺指数明显低于模型组，表明药物治疗有效；水煎液组肺指数较模型组显著降低，说明金银花水煎液能抑制流感病毒所致肺病变。通过水煎液组的肺指数和肺指数抑制率与利巴韦林组相比，说明金银花水煎液与利巴韦林在抑制肺部病变上效果相似。

2.6小鼠脾脏、胸腺指数结果见表4，水煎液组与模型组比较，小鼠的胸腺指数显著提高，脾脏指数没有提高；水煎液组小鼠胸腺指数与正常组和利巴韦林组相似，胸腺是T淋巴细胞成熟的场所，它与免疫功能相关，说明金银花水煎液可以通过提高胸腺指数来提高免疫功能。

表4　金银花水煎液对流感病毒感染小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响（m g·g-1）

2.7小鼠血清IFN-γ的含量

表5　金银花水煎液对流感病毒感染小鼠IFN-γ含量的影响

表5　金银花水煎液对流感病毒感染小鼠IFN-γ含量的影响

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

脾脏指数（mg·g-1）5.64±3.05#模型组1.55±0.46*3.70±1.17*利巴韦林组2.54±0.44#2.79±0.52水煎液组2.70±1.06#3.40±0.99组别胸腺指数（mg·g-1）正常组2.48±1.10#

结果见表5，模型组小鼠血清IFN-γ的含量显著低于正常组（P<0.05），说明造模成功。金银花水煎液能够显著提高小鼠抗体水平（P<0.05），使其恢复至与利巴韦林组相当水平，说明金银花水煎液具有免疫促进作用。

3　讨论

流感病毒是一种对人类健康造成极大威胁的常见呼吸道传染病毒，流感病毒导致机体抵抗力下降，肺组织受到感染，出现肺部严重充血和水肿，病变程度日益加重。目前，用于治疗流感病毒感染的疾病多数是合成药物，对机体的毒副作用比较大。金银花水煎液作为传统中药，对机体的毒副作用较小，故采用金银花水煎液来研究其抗流感病毒的作用。

研究表明，小鼠流感病毒感染致命的原因多是宿主的免疫病理损伤，并不是病毒所导致直接细胞病理的改变。IFN-γ主要是由活化的NK细胞和T细胞产生的，是动物机体重要的细胞因子，具有强大的免疫调节作用、抗肿瘤和抗病毒作用［5］。细胞因子IFN-γ能增强MHC-4类和Ⅲ类抗原的表达，促进T细胞和B细胞的分化，促进CD4+T细胞分化成TH1亚群，抑制TH2细胞的增殖，增强NK细胞的杀伤活性，激活单核-巨噬细胞方面的作用，具有抗病毒及免疫调节作用［6］。水煎液组小鼠血清中IFN-γ较模型组明显增多，说明金银花水煎液能促进IFN-γ的分泌，起到抗病毒作用，增强机体免疫功能。

实验证明，感染流感病毒后小鼠肛温开始下降，金银花水煎液干预治疗后，小鼠肛温逐渐回升，体征有不同程度改善，肺部病变程度显著减轻，肺指数在一定程度上降低，肺指数抑制率、胸腺指数在一定程度上提高，死亡率降低。

综上所述，金银花水煎液对防治流感病毒的感染有显著作用，其进入受流感病毒感染的机体后，抑制病变程度，使机体的免疫功能明显增强，此结论为金银花水煎液临床应用提供科学的实验依据。

［1］马月霞.常用中药注射液不同配伍抗小鼠甲型H1N1流感重症肺炎的疗效研究［D］.北京：北京中医药大学，2014：5.

［2］朱红红，尹鸿萍.盐藻多糖抗病毒实验研究［J］.南京中医药大学学报，2007（5）:310-312.

［3］彭绍忠，李耿，秦臻，等.广藿香不同提取部位体内抗流感病毒作用研究［J］.时珍国医国药，2011（11）:2578-2579.

［4］田连起.大青龙汤抗甲型H1N1流感病毒及解热的药效物质基础研究［D］.武汉：湖北中医药大学，2013：5.

［5］杨鸿，邓桦，卢月媚，等.玉屏风复合多糖对免疫低下小鼠血清IL-2和IFN-γ含量的影响［J］.安徽农业科学，2014（12）:3571-3572.

［6］李荣荣，杨勇，容蓉，等.麻黄细辛附子汤对肾阳虚外感模型小鼠的干预作用［J］.中国实验方剂学杂志，2013（3）:226-230.

ZHu mingzhu MAO shUmin LIu yUhong WANG lina CHENtianyu QINle XING baiying
（College of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Ji'nan 250355， China）

Objective To exP1ore the effect of Lonicera jaPonica Water decoction on inf1uenza virus infected mice.Methods The mice Were random1y divided into four grouPs，With 12mice in each grouP，inc1uding norma1grouP，mode1grouP，Water decoction grouPand ribavirin grouP.We PrePared mouse virus mode1by inf1uenza virus in nasa1cavity.The recta1temPerature，death rate，thymus index，sP1een index，1ung index and serum IFN-γ content Were measured.Results The 1onicera jaPonica Water decoction marked1y imProved the thymus index，sP1een index，1ung index inhibition rate，increased the serum IFN-γ content，reduced 1ung index，he1Ped to recover the recta1temPerature，and reduced death rate.Conclusion The antivira1effect of 1onicera jaPonica Water decoction on inf1uenza virus infection in mice is significant.

inf1uenza virus；1onicera jaPonica Water decoction；exPerienta1study

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.09.059

1672-2779（2016）-09-0135-03

山东省自主创新专项项目（No：2013CXC20401）；山东中医药大学大学生研究训练（SRT）计划资助项目（No:2015349）

请补充通讯作者邮箱

（本文编辑：张文娟本文校对：张文娟2016-02-01）