“退热六法”对不同月龄幼兔退热效果及TLR4/NF-κB信号通路的影响

焦 谊，刘志凤，于天源*，张英琦，刘 迪,2，王厚融，徐亚静，官 乾

(1.北京中医药大学，北京 102488；2.北京中医药大学东方医院，北京 100078)

发热作为儿科常见的症状之一，发生率为25.7%，每人每年约0.8次[1]。长期发热或体温过高则会损害机体调节功能，使病情恶化。小儿推拿退热具有安全性和有效性[2]，其中以开天门[3]、推坎宫[3]、揉太阳[3]、揉耳后高骨[4]、清天河水[5]、推脊[6]手法最为常用。但小儿推拿退热的最适年龄、最适温度、最适类型等标准，研究不够深入。故选取脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）模型模拟临床细菌性发热，选取不同月龄幼兔模拟不同年龄患儿，明确推拿退热的最适年龄，并进一步选取最适年龄幼兔探究推拿退热的机理。

视前区-下丘脑前部（POAH）是体温调节的基本中枢，也是最重要的体温调节中枢，LPS作为Toll样受体4（TLR4）公认的配体，能刺激机体产生炎症反应，核转录因子kappaB（NF-κB）参与机体免疫调节、炎症反应、感染、细胞周期调控、细胞分化及凋亡等[2]，发热过程以炎症介质如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素IL-1β（interleukin-1β，IL-1β）最为重要，故以退热六法为例，设计实验进行深入研究。

1 材料及方法

1.1 实验动物及分组

清洁级1、3月龄新西兰雄兔各16只，2月龄新西兰雄兔24只，肛温（39.00±0.50）℃，购自北京隆安实验动物养殖中心[合格证号为SCXK（京）2019-0006]。饲养于北京中医药大学动物实验室，温度（25±0.5）℃，相对湿度（65±5）%，12h/12h明暗周期，自由饮食饮水。适应性饲养3天，排除肛温波动大于0.4℃的新西兰兔。随机将1、3月龄幼兔分为模型组8只、推拿组8只，2月龄幼兔随机分为正常组8只、模型组8只、推拿组8只。实验程序经北京中医药大学动物使用和管理委员会批准，符合动物福利与伦理原则。

1.2 主要器材及试剂

1.2.1 主要器材及仪器 MultiSkan3酶标仪（美国THERMO公司）；冷冻离心机（德国EPPENDORF公司）；BL-420N（成都泰盟软件有限公司）；Bio Drop （Biochrom公 司）；T100TM Thermal Cycler PCR仪、CFX ConnectTMReal-Time System定 量PCR仪、ChemiDoc MP成像仪（美国BIO-RAD公司）。

1.2.2 主要试剂 大肠杆菌内毒素脂多糖（美国Sigma公司；批号055：B5 L2880）；BCA蛋白浓度测定试剂盒、细胞核蛋白提取试剂盒、PMSF、RIPA裂解液（北京索莱宝科技有限公司）；TLR4抗体（批号：bs-20594R）、NF-κB p65抗体（批号：bs-0465R）、GAPDH抗体（批号：bsm-0978M）；HRP二抗（批号：ZB-2301、ZB-2305）；高灵敏度化学发光检测试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；HiPure Total RNA Micro Kit（批号：R4114-02）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美国THERMO公司；批号：K1622）。

1.3 模型制备

清醒状态下，模型组和推拿组耳缘静脉注射浓度为0.5 μg·mL-1LPS，注射量为1 mL·kg-1，注射后1h内肛温上升超过0.6℃为造模成功，正常组不予处理[3-4]。

1.4 分组处理

推拿组由推拿学科专业人员操作，且都为同一人干预。造模后1 h干预1次。1）开天门。定位：两眉骨内侧中点至神庭（前正中线，额顶骨缝交界处）[10]，操作：用拇指自下而上交替直推200次，2 min[11]；2）推坎宫。定位：睛明（内眼角，上下眼睑交界处）直上至丝竹空（眶上突外端）[10]，操作：用两拇指桡侧自眉心向眉梢做分推200次，2 min[11]；3）揉太阳。定位：太阳（外眼角后上方颞窝中）[10]，操作：用两拇指桡侧推运200次，2 min[11]；4）揉耳后高骨。定位：寰椎翼前缘直上方凹陷处[10]，操作：用两拇指或中指端揉24次掐3下，2 min[11]；5）清天河水。定位：腕横纹至肘横纹[10]，操作：用食中指指面自腕推向肘，推500次，5 min[12]。6）推脊。定位：大椎（背中线上，第7颈椎与第1胸椎棘突间）至尾根[10]，操作：用食中二指自上而下直推300次，作5 min[11]。正常组和模型组正常饲养。

1.5 取材及指标检测

1.5.1 肛温监测 采用BL-420N监测肛温变化。肛温探头涂上适量石蜡油，插入肛门固定为5 cm，待稳定后读数，作为幼兔的肛温，之后每隔20 min记录1次肛温，连续监测6 h。

1.5.2 ELISA检测血浆、下丘脑TNF-α、IL-1β含量选取二月龄幼兔，于造模后3 h（即推拿后2 h）腹主动脉取血5 mL，置于绿色真空采血管中，室内保存20 min内进行离心，4℃ 3 000 r·m-1离心20 min，取上清置于EP管保存，按ELISA试剂盒方法测定血浆、下丘脑中TNF-α、IL-1β含量。

1.5.3 Western Blot检测下丘脑组织 TLR4、NF-κB p65蛋白表达 选取二月龄幼兔，于造模后3 h腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL·100 g-1），抽取腹主动脉血后取出下丘脑组织约200 mg，将组织分成两部分，一部分用于提取细胞核蛋白，另一部分提取细胞膜蛋白。BCA蛋白试剂盒进行蛋白定量。配置10%分离胶和5%浓缩胶，上样后稳定电泳浓缩胶60V、分离胶80 V，冰上电转100 V 70 min，10%脱脂奶粉封闭2 h，一抗（TLR4 1:2 000，NF-κB p65 1:2 000，GAPDH 1:2 000）室温摇床孵育1 h后4℃冰箱过夜，孵育二抗（羊抗兔IgG 1:10 000，羊抗小鼠 IgG 1:10 000），成像仪显影，Image Lab图像分析软件分析目的条带，定量分析各蛋白条带灰度值。

1.5.4 PCR检测下丘脑组织TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA表达按 HiPure Total RNA Micro Kit试剂盒和RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒操作步骤提取总RNA，逆转录成cDNA。GAPDH上游引物：ACTCTGGCAAAGT GGATGTTGTCG,下游引物：CCGTGGGTGG AATCATACTGGAAC；TLR4上游引物：GAGGAG GCTGTTGGTGGAAGTTG；下游引物：GCACACT GAATACTGACACGCTAATG，NF-κB上游引物：GCATCACAGCAGGCGAACTCTC；下游引物：TGCTTCTCGGCTACCACTGACTC，TNF-α上游引物：CGCCATGAGCACTGAGAGTATGATC； 下 游引物：CAGCCACGAGCAGGAAAGAGAAG；IL-1β上游引物：GGCAGGTCTTGTCAGTCGTTGTG，下游引物：GCAGAGGACGGGTTCTTCTTCAAAG。所有cDNA样品扩增，分别收集内参GAPDH以及目的基因的Cq值，根据2-△△Cq公式计算相对表达量。

1.6 统计学方法

所有数据录入SPSS 26.0软件进行分析，数据符合正态分布且方差齐性，以均数±标准差（±s）表示，数据均呈正态分布并且方差齐，以单因素方差分析（one-way ANOVA）进行组间比较，组间两两比较以LSD检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 各月龄幼兔模型组肛温基础线比较

见图1、表1。

图1 各月龄模型组幼兔肛温曲线图（±s ）（8只兔/组）

表 1 各月龄模型组幼兔肛温6 h变化表（±s，n = 8） ℃

表 1 各月龄模型组幼兔肛温6 h变化表（±s，n = 8） ℃

注：与正常组比较，# P＜0.05；与1月龄模型组比较，△P＜0.05

组别 造模前 造模后1 h 造模后2 h 造模后3 h 造模后4 h 造模后5 h 造模后6 h正常组 39.10±0.23 39.06±0.16 39.05±0.14 39.09±0.11 39.08±0.16 39.11±0.14 39.11±0.12 1 月龄模型组 39.14±0.33 40.05±0.12# 40.25±0.26# 40.48±0.37# 40.36±0.31# 39.86±0.45# 39.41±0.43 2月龄模型组 39.16±0.23 40.15±0.40# 40.43±0.50# 40.85±0.67# 40.85±0.56#△ 40.54±0.52#△ 39.98±0.49#△3月龄模型组 39.06±0.39 40.20±0.29# 40.35±0.29# 41.03±0.58#△ 40.93±0.57#△ 40.40±0.60#△ 39.89±0.39#△

2.2 1月龄幼兔退热情况

见表2、图2。

图2 1月龄幼兔肛温变化曲线图（±s ）

表 2 1月龄幼兔肛温变化表（±s，n = 8） ℃

表 2 1月龄幼兔肛温变化表（±s，n = 8） ℃

注：与正常组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组别 造模前 造模后1 h 造模后2 h 造模后3 h 造模后4 h 造模后5 h 造模后6 h正常组 39.10±0.23 39.06±0.16 39.05±0.14 39.09±0.11 39.08±0.16 39.11±0.14 39.11±0.12模型组 39.14±0.33 40.05±0.12# 40.25±0.26# 40.48±0.37# 40.36±0.31# 39.86±0.45# 39.41±0.43推拿组 39.15±0.27 40.21±0.38# 39.23±0.54△ 39.97±0.66#△ 40.10±0.46# 39.60±0.29# 39.42±0.43

2.3 2月龄幼兔退热情况

见表3、图3。

图3 2月龄幼兔肛温变化曲线图（±s ）

表3 2月龄幼兔肛温变化表（±s，n = 8） ℃

表3 2月龄幼兔肛温变化表（±s，n = 8） ℃

注：与正常组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组别 造模前 造模后1 h 造模后2 h 造模后3 h 造模后4 h 造模后5 h 造模后6 h正常组 39.10±0.23 39.06±0.16 39.05±0.14 39.09±0.11 39.08±0.16 39.11±0.14 39.11±0.12模型组 39.16±0.23 40.15±0.40# 40.43±0.50# 40.85±0.67# 40.85±0.56# 40.54±0.52# 39.98±0.49#推拿组 39.11±0.14 40.08±0.13# 39.54±0.49#△ 39.82±0.58#△ 40.14±0.59#△ 40.06±0.48#△ 39.87±0.42#

2.4 3月龄幼兔退热情况

见表4、图4。

图4 3月龄幼兔肛温变化曲线图（±s ）

表4 3月龄幼兔肛温变化表（±s，n = 8） ℃

表4 3月龄幼兔肛温变化表（±s，n = 8） ℃

注：与正常组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组别 造模前 造模后1 h 造模后2 h 造模后3 h 造模后4 h 造模后5 h 造模后6 h正常组 39.10±0.23 39.06±0.16 39.05±0.14 39.09±0.11 39.08±0.16 39.11±0.14 39.11±0.12模型组 39.06±0.39 40.20±0.29# 40.35±0.29# 41.03±0.58# 40.93±0.57# 40.40±0.60# 39.89±0.39#推拿组 39.08±0.14 40.21±0.27# 39.69±0.81#△ 40.11±0.79#△ 40.36±0.58#△ 40.16±0.34# 39.94±0.28#

2.5 3个不同月龄幼兔的退热情况

见表5。

表5 3个不同月龄幼兔的退热情况（±s，n= 8）

表5 3个不同月龄幼兔的退热情况（±s，n= 8）

注：与1月龄比较，# P＜0.05；与2月龄比较，△P＜0.05

不同月龄 造模1 h肛温/℃ 推拿后最低肛温/℃ 推拿降低肛温最大幅度/℃ 推拿抑制发热时程/min 1 月龄 40.21±0.38 38.88±0.58 1.33±0.5 57.50±29.15 2 月龄 40.08±0.13 39.28±0.54 0.80±0.51# 192.50±93.77#3 月龄 40.21±0.27 39.47±0.53# 0.74±0.43# 74.29±55.03△

2.6 2月龄幼兔血浆和下丘脑中炎症因子的表达情况

见表6。

表6 2月龄LPS致热幼兔血浆和下丘脑中炎症因子表达情况（±s，n = 8） ng·mL-1

表6 2月龄LPS致热幼兔血浆和下丘脑中炎症因子表达情况（±s，n = 8） ng·mL-1

注：与正常组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组别 血浆下丘脑TNF-α IL-1β TNF-α IL-1β正常组 231.72±8.93 66.48±2.83 228.21±7.02 50.13±3.42模型组 268.00±15.57# 71.50±2.89# 256.13±12.35# 56.38±1.27#推拿组 242.17±6.30△ 66.87±1.83△ 233.24±6.95△ 51.21±2.30△

2.7 2月龄幼兔下丘脑中TLR4/NF-κB p65 蛋白含量表达情况

见图5、表7。

表7 2月龄LPS致热幼兔下丘脑TLR4/NF-κB p65含量表达情况（±s，n= 8）

表7 2月龄LPS致热幼兔下丘脑TLR4/NF-κB p65含量表达情况（±s，n= 8）

注：与正常组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组别 相对灰度值TLR4/GAPDH 细胞核 NF-κB p65/GAPDH正常组 0.25±0.12 0.15±0.07模型组 0.47±0.08# 0.88±0.45#推拿组 0.34±0.13△ 0.29±0.20△

图5 2月龄LPS致热幼兔下丘脑TLR4/NF-κB p65条带图

2.8 2月龄幼兔下丘脑中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA表达情况

造模后3 h，模型组下丘脑中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA高于正常组（P＜0.05）；推拿组下丘脑中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA低于模型组（P＜0.05）。见图6。

图6 各组2月龄下丘脑相关mRNA表达情况

3 讨论

3.1 “退热六法”对不同月龄幼兔的退热效果

实验选取1月、2月、3月龄幼兔模拟临床发热易感的3个年龄段[13-14]，即婴儿期（28天～1岁）、幼儿期（1岁～3岁）、学龄前期（3岁～6岁），从而初步得出小儿推拿退热的最适年龄。

研究结果发现，“退热六法”干预1月龄幼兔降温幅度最大，2月龄次之；“退热六法”干预2月龄幼兔降温最稳定，3月龄次之。所以，临床上年龄越小的退热效果可能短时间内较好，长时间可能会出现体温反复，可增加治疗次数，对于年龄较大的患儿，降温效果比较稳定，短期降温效果虽不如1月龄，但体温波动较小，从整个退热过程来看，推拿都起到了正向调节作用。根据结果显示，选取2月龄幼兔作为后续研究退热机制的实验动物。

3.2 “退热六法”对LPS致热幼兔可能的退热机制

临床上推拿退热效果显著，推拿能下调发热患儿外周血清TNF-α、IL-6、IL-8等炎症因子水平[15]。因此，本研究探讨了推拿对炎症性发热的影响，结果提示推拿能明显抑制发热体温，抑制炎症反应，可能是通过TLR4/NF-κB p65信号通路实现。

根据研究发现，耳缘静脉注射0.5 μg·kg-1的LPS，造模后1 h肛温明显升高，造模后3 h肛温达最高峰，与基础肛温相比，约上升1.3～2.0℃，随后肛温逐渐下降，持续约6 h，与研究[9]相符。选取“退热六法”作为干预方式，其中头面四大手法属于“和法”，可调节阴阳，天人相应，天河水倍受历代医者的推崇，均认为清天河水是“清法”的重要代表，在各种热证下均可施用，脊椎占督脉近三分之二的循行部位，推脊对督脉气机有调节作用。

发热是体温调节系统紊乱的表现，是反应炎症性疾病的重要标志，TLR4介导的信号转导参与了慢性和急性炎症反应[16]，其中TLR4/NF-κB信号通路是引起发热的重要传导途径[17]。炎性细胞因子能影响免疫反应，并对各种组织或器官造成损伤[18]，TNF-α、IL-1β参与调节早期免疫反应[19]，是发热的关键介质。有研究[20]表明注射TNF-α血清抗体只能影响发热的早期阶段，这与推拿后能即刻降低体温相似。脂多糖是一种典型内毒素，作为配体可以激活细胞膜上的TLR4，通过一系列反应诱导NF-κB p65入核，启动下游炎症反应，上调促炎细胞因子。

综上所述，“退热六法”能下调外周血中炎症因子的表达，同时下调中枢中TLR4的表达，以及细胞核NF-κB p65的表达。说明推拿可能是通过抑制TLR4/NF-κB信号通路起到抗炎解热作用。