GSTM1和GSTP1基因多态性与卵巢癌发生风险的关系

蔡巧青，江　丽，陈细英，陈丕绩

(1.北京大学深圳医院妇产科，广东 深圳 518035；2深圳市第七人民医院检验科，广东 深圳 518081)



GSTM1和GSTP1基因多态性与卵巢癌发生风险的关系

蔡巧青1，江丽1，陈细英1，陈丕绩2

(1.北京大学深圳医院妇产科，广东 深圳 518035；2深圳市第七人民医院检验科，广东 深圳 518081)

目的探讨GSTM1和GSTP1基因多态性与卵巢癌发生风险的关系。方法选择2013年1月至2015年6月在北京大学深圳医院确诊为卵巢癌的手术患者124例为病例组，选取同时期来本院体检的健康女性124例为对照组。于清晨抽取所有研究对象4mL外周静脉血，用于multiplex-PCR和PCR-RFLP检测研究对象的GSTM1和GSTP1基因的多态性，并对结果进行分析。结果病例组GSTP1基因GG型分布频率为28.2%，与健康对照组相比差异有统计学意义(χ2=5.511，P<0.05),且GSTP1基因GG型可能会增加患卵巢癌的风险(OR=2.259，95%CI：1.14～4.50，P<0.05)，携带GSTP1基因GG型患者患卵巢上皮性癌的比例明显高于卵巢非上皮性癌(χ2=4.017，P<0.05)；而GSTM1各基因型分布与健康对照组相比差异均无统计学意义(均P>0.05)，且与卵巢癌的发生风险无关联。结论GSTP1基因多态性与卵巢癌的发病风险有关联，其GG型可能会增加卵巢上皮性癌的发病风险；而GSTM1基因则与卵巢癌的发病风险无关。

卵巢癌；基因多态性；GSTP1基因；GSTM1基因；发生风险

[Abstract]Objective To study the relationship between polymorphism of GSTM1 and GSTP1 genes and the risk of ovarian cancer. Methods Totally 124 patients with ovarian cancer identified in Peking University Shenzhen Hospital between January 2013 and June 2015 were selected in case group. At the same period 124 healthy females for physical examination in the hospital were selected in control group. In morning 4 mL peripheral venous blood was drawn from all cases for multiplex-PCR and PCR-RFLP to detect GSTM1 and GSTP1 gene polymorphism. Results were analyzed. Results The GG genotype frequency of GSTP1 gene in the case group was 28.2%, which was significantly different from that in the control group (χ2=5.511,P<0.05). And GG genotype of GSTP1 gene might increase the risk of ovarian cancer (OR=2.259，95%CI:1.14-4.50,P<0.05) . The cases carrying GG genotype had a higher proportion of developing ovarian epithelial neoplasms than non-epithelial ovarian cancer (χ2=4.017,P<0.05). However, the distribution of genotypes of GSTM1 was not significantly different from that of the control group (P>0.05), and there was no association with the risk of ovarian cancer. Conclusion There is a link between GSTP1 gene polymorphism and the risk of ovarian cancer, and GG genotypes may increase the risk of ovarian epithelial neoplasms. But GSTM1 gene is not associated with the risk of ovarian cancer.

[Key words]ovarian cancer；gene polymorphism；GSTP1；GSTM1； risk of occurrence

卵巢癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤之一，其发病率仅次于乳腺癌和宫颈癌，居第三位[1]。由于卵巢位于盆腔内，发生癌变后早期不易观察症状，待癌细胞发生扩散和转移后才被发现。因此，70%以上的患者治疗时已发展为卵巢癌晚期，也导致了其5年生存率极低[2]。基因的遗传变异与卵巢癌的发病有着密切的联系。Ⅰ相代谢酶基因和Ⅱ相代谢酶基因是与肿瘤易感性相关的两大类基因。谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)作为人体重要的Ⅱ相代谢酶家族之一，存在于人体的许多组织中，具有较强的解毒作用，能保护细胞[3]。GSTs存在基因多态性，且会导致其酶活性发生改变，进一步影响GSTs的解毒能力，增加了多种疾病的发病风险，如非小细胞肺癌、前列腺癌、肺癌等，并且对肿瘤患者治疗后的生存也有影响。因此，本研究检测卵巢癌患者的GSTM1和GSTP1基因多态性，探讨GSTM1和GSTP1基因突变与卵巢癌发生风险的关系，以期为卵巢癌的早期预防提供科学的诊断指标。

1资料与方法

1.1一般资料

选择2013年1月至2015年6月在北京大学深圳医院确诊为卵巢癌的手术患者124例为病例组，年龄为23～71岁，平均年龄(51.3±3.3)岁。纳入标准：①经确诊为卵巢癌患者；②无其他恶性肿瘤史；③未接受任何治疗；④无年龄、病理类型及临床分期的限制；⑤自愿参加本次研究。选取同时期来本院体检的健康女性124例为对照组，年龄为22～69岁，平均年龄(50.7±4.3)岁。入选标准：①无肿瘤病史；②与病例组无任何血缘关系；③自愿参加本次研究。纳入的研究对象248例为我国广东地区的汉族女性，本研究获得所有研究对象及其监护人的知情同意。

1.2方法

1.2.1资料分析

对所有卵巢癌患者的临床资料(年龄、临床表现、临床病理分期及类型等)进行分析。

1.2.2血液标本采集

所有研究对象空腹12小时，于清晨抽取4mL外周静脉血，经EDTA.K2抗凝，于4小时内保存于-80℃冰箱备用，严格按照试剂盒说明书进行操作，1周内集中提取DNA。

1.2.3 SNP测序

采用multiplex-PCR检测GSTM1纯合缺失。GSTM1基因分型：内参照为扩增白蛋白基因，GSTM1基因引物为20pmol，上游引物序列为5′-TTCCTTACTGGTCCTC-ACATCTC-3′，下游引物序列为5′-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3′。PCR反应体系25μL，4×dNTP 3μL、10×buffer 2.5μL、MgCl2用量为3mmol/L、Taq DNA聚合酶1.5IU、DNA样品1μL，上、下游引物各1μL。PCR反应条件：95℃预变性5分钟后、进行35个循环(95℃ 45秒，62℃ 45秒，72℃ 45秒)、延伸7分钟72℃。PCR产物进行电泳基因型分析条件：含溴化乙啶2%琼脂糖凝胶。

采用PCR-RFLP检测GSTP1第303位碱基发生A→G突变。GSTP1基因分型：GSTP1基因引物为10pmol，上游引物序列为5′-ACGCACATCCTC2TTCCCCTC-3′，下游引物序列为5′-TACTTGGCTG2GTTGATGT2CC-3′。PCR反应体系25μL，4×dNTP 2.0μL、10×buffer 2.5μL、MgCl2用量为2.5mmol/L、Taq DNA聚合酶1.0IU、DNA样品0.5μL，上、下游引物各1μL。PCR反应条件：95℃预变性2分钟后，进行35个循环(94℃ 30秒，66℃ 30秒，72℃ 2分钟)，最后72℃延伸5分钟。取5μL PCR产物与0.5μL Alw 26I(10IU/μL)在37℃温育2小时，限制性内切酶产物在含溴化乙啶的2.5%琼脂糖凝胶电泳分析基因型。

1.3统计学方法

所获数据采用SPSS 21.0软件包进行统计学分析处理，基因型分布采用Hardy-Weinberg遗传平衡检验，计数资料采用χ2检验，用比值比(OR)及其95%可信区间(95%CI)表示风险度，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1一般资料的情况

本研究共采集了124例卵巢癌患者标本，国际妇产科联盟(FIGO)分期：Ⅰ～Ⅱ级43例；Ⅲ～Ⅳ级81例；临床表现：腹痛、腹胀104例，阴道不规则流血11例，排尿、排便困难9例；临床病理类型：卵巢上皮性癌99例；卵巢非上皮性癌25例，见表1。

2.2 PCR产物电泳结果情况

GSTM1基因型判断：PCR扩增后，白蛋白基因产生350bp片段，GSTM1基因非缺失型(+)产生219bp片段；而GSTM1基因缺失型(-)无相应的扩增产物，见图1A。

GSTP1基因型判断：野生型(AA)为1个片段，440bp；纯合突变型(GG)为2个片段，227bp和213bp；突变杂合型(AG)为3个片段，440bp、227bp和213bp。由于227bp和213bp这2个片段长度接近，所以在2.5%琼脂糖凝胶中无法分开，但不影响结果判断，在电泳图谱上GG型可看到1条带，AG型可看到2条带，见图1B。

变量病例组(n=124)对照组(n=124)χ2/tP平均年龄51.3±3.350.7±4.31.233>0.05月经初潮年龄16.4±1.616.1±1.51.523>0.05妊娠0.261>0.05 0～3次58(46.8)54(43.5) >3次66(53.2)70(56.5)绝经状态0.261>0.05 是71(57.3)67(54.0) 否53(42.7)57(46.0)临床病理分期 Ⅰ、Ⅱ级43(34.7)- Ⅲ、Ⅳ级81(65.3)-临床表现- 腹痛、腹胀104(83.9) 阴道不规则流血11(8.9)- 排尿、排便困难9(7.2)-临床病理类型 卵巢上皮性癌99(79.8)- 卵巢非上皮性癌25(20.2)-

注：A为GSTM1基因电泳图；B为GSTP1基因电泳图

图1GSTM1和GSTP1的酶切产物

Fig.1Enzyme digestion products of GSTM1 and GSTP1

2.3 GSTM1和GSTP1多态性基因型和等位基因频率以及与卵巢癌发生风险的情况

在124例晚期卵巢癌病例中，经Hardy-Weinberg遗传平衡检验证实GSTM1和GSTP1基因型分布符合遗传平衡定律。经非连续性χ2检验，病例组和对照组GSTM1不同基因型频率比较差异无统计学意义(χ2=0.797，P>0.05)。病例组GSTP1基因GG型的分布频率为28.2%，与健康对照组相比，差异有统计学意义(χ2=5.511，P<0.05)，提示等位基因G为危险基因，GSTP1基因GG型可能会增加患卵巢癌的风险(OR=2.259，95%CI：1.14～4.50，P<0.05)，见表2。

表2　GSTM1/GSTT1/GSTP1多态性基因型和等位基因频率以及与卵巢癌发生风险的比较[n(%)]

注：*每对基因型含有2个等位基因，分母为248。

2.4 GSTM1和GSTP1多态性与卵巢癌易感性的分层分析

GSTM1基因的GSTM1(+)型患者罹患卵巢癌的比例与GSTM1(-)型患者相比差异无统计学意义(χ2=0.797，P>0.05)，且携带GSTM1(+)基因型和GSTM1(-)基因型患者患上皮性癌的比例与患卵巢非上皮性癌相比，差异无统计学意义(χ2=0.344，P>0.05)；携带GSTP1基因GG型患者患卵巢上皮性癌的比例明显高于GSTP1基因AA基因型患者，差异有统计学意义(χ2=11.660，P<0.05)，且GG型患者患卵巢上皮性癌的比例高于卵巢非上皮性癌，差异有统计学意义(χ2=4.017，P<0.05)，见表3。

表3　　GSTM1和GSTP1多态性和卵巢癌易感性的分层分析[n(%)]

3讨论

3.1谷胱甘肽S-转移酶基因多态性

GSTs存在于人体的许多组织中，作为人体重要的毒物代谢酶之一，具有较强的解毒作用，能清除多种毒性物质[4]。GSTs的基因多态性影响了其酶活性在人体中的表达，当酶活性发生改变时，GSTs的解毒能力也会发生改变，增加了特定肿瘤的发病风险[5]。Ebrahimkhani等[6]发现GSTT1基因缺失型会增加结直肠癌的发病风险，且危险因素—吸烟和相关代谢酶多态性的联合作用也会增加罹患结直肠癌的可能性。Jiang等[7]在研究中也指出GSTT1和GSTM1基因多态性与肺癌易感性有关。

3.2谷胱甘肽S-转移酶基因多态性与肿瘤的相关性

GSTs家族成员GSTM1、GSTT1和GSTP1基因具有多态性，已有研究证实，GSTT1(-)可能会增加卵巢癌的发病风险。GSTM1基因发生突变后，酶活性会降低甚至是完全丧失活性[8]。GSTP1基因第303位碱基发生A→G突变后酶活性降低，且不同基因型的酶活性也有差异，其中野生型(GG)表达的酶活性最低，对毒性物质的清除能力也最低，增加了多种疾病的发生风险[9]，如非小细胞肺癌、前列腺癌、食管癌、急性髓系白血病等。已有大量研究[10-13]证实，GSTM1和GSTP1基因多态性增加多种肿瘤的发病风险，原因在于GSTs可以保护正常细胞免受亲电子致癌物的侵袭，而GSTs多态性会导致此能力下降，携带GSTM1和GSTT1基因缺失型以及GSTP1变异基因型者罹患肿瘤的风险增加。

3.3 GSTM1/GSTP1基因多态性与卵巢癌的相关性

目前鲜有关于GSTM1、GSTP1基因多态性与卵巢癌发生风险的研究。因此，本课题研究了GSTM1和GSTP1基因多态性对卵巢癌发生风险的影响。

本研究发现，病例组GSTP1基因GG型基因频率显著高于健康对照组，差异有统计学意义，提示携带GG基因型的个体患卵巢癌的风险可能会增加，作用机制是GSTP1基因发生突变，导致携带GG型的患者酶活性显著降低，不能及时清理毒性物质，增加了患卵巢癌的风险。石秀娥等[12]的研究也表明，急性髓系白血病患者的GSTP1基因GG型基因频率低于健康人群。本研究还发现GSTP1基因GG型主要增加患卵巢上皮性癌的风险，与卵巢非上皮性癌无明显关系。

本研究未发现GSTM1基因多态性与卵巢癌的发生风险有关。Tecza等[14]的研究显示GSTM1(-)基因型对卵巢癌具有保护作用。GSTM1多态性与卵巢癌易感性的研究结果存在很大的差异，造成此种现象的原因可能是地区和种族不同。本研究纳入对象仅为广东地区汉族女性，结果显示GSTM1多态性与卵巢癌的易感性无关，而GSTP1基因GG型会增加罹患卵巢癌的风险，尤其是卵巢上皮性癌。其说明了GSTP1多态性可能会增加我国广东地区汉族女性罹患卵巢癌的风险。

3.4结论与展望

目前，国际上有关GSTs基因多态性与卵巢癌易感性的研究主要以白种人为研究对象，与其他特异性人种的研究甚少。因此，在亚洲人种中GSTs基因多态性与卵巢癌的相关性需要行进一步研究。

综上所述可以得出以下结论：GSTP1基因GG型可能会增加患卵巢上皮性癌的发病风险。本研究在临床具较强的可行性，其结果也有较好的临床应用价值，且患者1次基因分型终身收益。但本研究样本量偏小，结果仍需在大样本量、多地区、多民族、多基因人群中进行重复研究和验证。

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[专业责任编辑：杨筱凤]

Correlation between polymorphisms of GSTM1 and GSTP1 genes and risk of ovarian cancer

CAI Qiao-qing1, JIANG Li1, CHEN Xi-ying1, CHEN Pi-ji2

(1.Department of Gynecology and Obstetrics,Peking University Shenzhen Hospital, Guangdong Shenzhen 518035, China;2.Shenzhen Seventh People’s Hospital, Guangdong Shenzhen 518081, China)

2016-03-06

蔡巧青(1983-)，女，主管护师，主要从事产科护理工作。

陈丕绩，副主任技师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.08.010

R737.31

A

1673-5293(2016)08-0933-04