瑞格列奈二甲双胍片微生物限度检查方法的建立

罗远纯　雷　杨　周　霜（遵义市食品药品检验所　遵义　563099）

瑞格列奈二甲双胍片微生物限度检查方法的建立

罗远纯雷杨周霜（遵义市食品药品检验所遵义563099）

目的：建立瑞格利奈二甲双胍片的微生物限度检查方法。方法：本实验用瑞格利奈二甲双胍片三批，按《中国药典》二部附录xI J（107-116）（以下简称Ch.P2010）［1，2］所载微生物限度检查法项下方法进行试验。结果：稀释剂采用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液加3%聚山梨酯-80、0.3%卵磷脂及0.1%L-组氨酸，细菌计数采用培养基稀释法（0.2mL/皿），霉菌及酵母菌计数采用常规法（1mL/皿），菌回收率可达70%以上，控制菌采用常规法（BL培养基100mL）试验组可检出目标菌。结论：本品供试液制备需在稀释液中添加中和剂，细菌计数采用培养基稀释法（0.2mL/皿），霉菌及酵母菌计数采用常规法（1mL/皿），大肠埃希菌检验采用常规法（BL培养基100mL）。

瑞格利奈二甲双胍 方法验证试验 回收率 中和剂

1　仪器设备及样品

仪器设备：DSx－280KB30型手提式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），电热鼓风干燥箱（上海－恒科学仪器有限公司），BHC－1300IIA2型生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司），GHP－9126型电热恒温培养箱（惠科电子有限公司），SPx－150型生化培养箱（惠科电子有限公司）。

样品：瑞格列奈二甲双胍片（贵州联盛药业有限公司，批号：141102、141103、141104，规格：1mg/500mg）

2　试验用菌种

①金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］第2代，②大肠埃希菌［CMCC（B）44102］第2代，③枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］第2代，④白色念珠菌［CMCC（F）98001］第2代，⑤黑曲霉菌［CMCC （F）98003］第2代，以上菌种均由贵州省食品药品检验所提供。

3　试验用培养基

营养琼脂培养基（批号130116），MUG培养基（批号130905），玫瑰红钠琼脂培养基（批号130218），胆盐乳糖培养基（批号1301052）

营养肉汤培养基：批号121205

改良马丁培养基：批号130121

改良马丁琼脂培养基：批号:1210122

以上培养基均购于北京三药科技开发公司。

pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液：批号20150610

卵磷脂（大豆）批号20150514

L-组氨酸批号20150514

带状疱疹是由水痘——带状疱疹病毒引起的以神经痛为主诉症状的皮肤病，全身各个部位均可发病，最好发于单侧的肋间神经或头面部三叉神经分布区。若三叉神经被疱疹病毒侵犯可出现单侧的偏头痛，呈针刺样、刀割样或跳痛，阵发性，多在晚上睡眠时疼痛加剧。头痛的同时有发生部位相应区域的眼痛、牙痛或耳痛，可伴发局部的麻木、蚁行感，甚至面瘫。

以上试剂均购于北京奥博星生物技术有限责任公司。

4　菌液的制备

4.1种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，于30℃～35℃培养18～24h，分别取各菌种培养液1mL加至9mL 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍依次稀释，金黄色葡萄球菌稀释至10-5、大肠埃希菌稀释至10-6、枯草芽孢杆菌稀释至10-6约为50～100cfu/mL，备用。

4.2接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，于23℃～28℃培养24～48h，取培养液1mL加入9mL 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍依次稀释至10-5约为50～100cfu/mL，备用。

4.3取黑曲霉的新鲜斜面培养物，用5mL含0.05%聚山梨酯-80 的0.9%氯化钠水溶液将孢子洗下，吸取此溶液1mL至9mL含0.05%聚山梨酯-80的0.9%氯化钠水溶液中，10倍依次稀释至10-6约为50～100cfu/mL，备用。

5　供试液的制备

取本品10g，加入含3%聚山梨酯-80、0.3%卵磷脂及0.1% L-组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，混匀，作为1∶10的供试液。

6　细菌、霉菌及酵母菌数计数方法验证试验

6.1试验组：

细菌：取1∶10供试液1mL，采用三种方法进行验证：方法①：常规法（1mL/皿）；方法②：0.5mL/皿；方法③：0.2mL/皿。每皿加入各菌液1mL，倾注营养琼脂培养基，每株菌分别制备平行样，至规定时间培养。

6.2菌液组：取已稀释好的各备用菌液1mL，倾注培养基，按规定培养，测定所加的试验菌数，每株试验菌平行制备2个平皿。

6.3供试品对照组：细菌：取1∶10供试液1mL：方法①：常规法（1mL/皿）。方法②：0.5mL/皿，方法③：0.2mL/皿。倾注营养琼脂培养基，按规定条件培养，测定本底数；霉菌及酵母菌：取1∶10供试液注入两个平皿，每皿1mL，按规定条件培养，测定本底数。

6.4稀释剂对照组：取含3%聚山梨酯-80、0.3%卵磷脂及0.1% L-组氨酸的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1mL替代供试液，加入平皿，再加入上述已稀释好的各备用菌液1mL，分别注入培养基，立即倾注培养基，至规定温度培养。每株试验菌平行制备2个平皿。

6.5试验组菌落回收率（%）=（试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数）×100%

稀释剂对照组菌落回收率（%）＝（稀释剂对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数）×100%

三种方法试验结果见表1、表2、表3

表1　细菌和霉菌、酵母菌方法①（1mL/皿）回收率试验结果

表2　细菌方法②（0.5mL/皿）回收率试验结果

表3　细菌方法③（0.2mL/皿）回收率试验结果

7　控制菌检查方法的验证

采用瑞格列奈二甲双胍片三个批号分别按《中国药典》2010版进行三次独立平行试验，验证采用的方法是否可行。结果如下：

7.1供试品：取三个批号样品1∶10供试液10mL分别接种至100mL胆盐乳糖培养基中，置30℃～35℃培养箱中培养18～24h。取上述培养物0.2mL分别接种至5mLMUG培养基中，按上述温度培养，分别于5h、24h在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。观察：管内培养物均不呈现荧光，MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面均呈试剂本色，靛基质阴性。结果：三批供试品均未检出大肠埃希菌。

7.2试验组：取三个批号样品1∶10供试液10mL及大肠埃希菌液规定量（相当于68cfu试验菌）分别接种至100mL胆盐乳糖培养基中，置35℃～37℃培养箱中培养18～24h。取上述培养物0.2mL分别接种至5mLMUG培养基中，于上述温度培养，分别于5h、24h在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。观察：管内培养物均呈现荧光，MUG阳性；观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面均呈玫瑰红色，为靛基质阳性。结果：试验组均检出大肠埃希菌。

7.3阴性（稀释剂）对照：取稀释剂10mL加入100mL胆盐乳糖培养基中，于30℃～35℃培养箱中培养18～24h，取上述培养物0.2mL接种至5mLMUG培养基中，于上述温度培养，分别于5h、24h在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。观察：管内培养物不呈现荧光，MUG阴性；观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈试剂本色，为靛基质阴性。结果：阴性（稀释剂）对照未检出大肠埃希菌。

7.4验证标准：阴性对照及供试品不得检出大肠埃希菌；试验组检出大肠埃希菌，该品种采用的大肠埃希菌检查法通过验证；若试验组未检出大肠埃希菌，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

7.5试验结果（表4～表6）：

表4　

表5　

表6　

7.6结论：取1∶10供试液10mL及大肠埃希菌规定量加入100mL胆盐乳糖培养基中，试验组检出试验菌（大肠埃希菌），供试品及阴性（稀释剂）对照均未检出大肠埃希菌。故可采用常规法进行大肠埃希菌检查。

8　验证结果分析与判断

8.1细菌、霉菌及酵母菌数计数：采用常规法（1mL/皿），大肠埃希菌、霉菌及酵母菌回收率均大于70%，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收率均小于70%；采用培养基稀释法（0.5mL/皿），枯草芽孢杆菌回收率大于70%，金黄色葡萄球菌回收率仍低于70%；采用培养基稀释法（0.2mL/皿），金黄色葡萄球菌回收率高于70%。结论：试验组细菌计数采用培养基稀释法（0.2mL/皿），霉菌及酵母菌计数采用常规法（1mL/皿）的菌回收率均大于70%，故可照该供试液制备方法和计数法测定瑞格列奈二甲双胍片的细菌、霉菌及酵母菌数。

8.2在控制菌三次独立平行试验中，采用常规法（BL100mL），供试品及阴性（稀释剂）对照均未检出阳性菌（大肠埃希菌），试验组检出阳性菌（大肠埃希菌）。结论：可采用上述供试液制备方法和大肠埃希菌检查常规法进行瑞格列奈二甲双胍片的大肠埃希菌检查。参考文献

［1］中国药典［S］2010版二部附录xI J，107-116.

［2］中国药品检验标准操作规范P351-358.

［3］国明，祝清芬，郑力真.无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析［J］.中国药品标准，2008，9（1）：46-49.

［4］赵丽元，张兴哲，刘英慧.中和法在微生物限度检查中的应用［J］.中国现代药物应用，2014，8（4）：5-6.

R927

B

1672-8351（2016）02-0138-02