黄连解毒汤配方颗粒中4种成分含量的测定及与传统汤剂的比较△

霍文杰　杜兰哲　李　慧　官永河　赵径华　陈向东（广东一方制药有限公司　佛山　528244）

黄连解毒汤配方颗粒中4种成分含量的测定及与传统汤剂的比较△

霍文杰杜兰哲李慧官永河赵径华陈向东（广东一方制药有限公司佛山528244）

目的：建立一种同时测定黄连解毒汤配方颗粒中4种成分（栀子苷、黄芩苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱）含量的HPLC方法，对黄连解毒汤配方颗粒和传统汤剂的主要色谱峰及成分含量进行比较。方法：采用菲罗门Gemini 5u C18110A色谱柱（250mm× 4.6mm，5μm），以乙腈为流动相A，以每100mL水中含1mL pH=6.0的醋酸-醋酸铵缓冲溶液为流动相B；梯度洗脱，体积流量为1.0mL/min，检测波长260nm，柱温30℃。结果：在39min内黄连解毒汤配方颗粒中栀子苷、黄芩苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱4种成分完全分离；回归方程显示4种成分的峰面积与其浓度呈良好的线性关系；4种成分的平均加样回收率（n=6）为95.02%～104.57%，RSD均小于3.0%；黄连解毒汤配方颗粒与传统汤剂的主要色谱峰的峰形峰位一致，成分含量相当。结论：该方法简单快捷，灵敏度高，稳定、重复性好，可用于黄连解毒汤配方颗粒的质量控制，黄连解毒汤配方颗粒与传统汤剂的主要成分一致，可为其替代传统汤剂作为理论依据。

黄连解毒汤 配方颗粒 高效液相色谱法 含量测定 传统汤剂

黄连解毒汤出自唐·《外台秘要》，由黄连、黄芩、黄柏和栀子4味药材组成，为清热解毒的经典方剂，具有清热、泻火、解毒功效。其中黄连、黄柏的主要有效成分为生物碱类，含有小檗碱、巴马汀和药根碱等；黄芩的主要成分为黄酮类，含有黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素等；栀子的主要成分有栀子苷，属环烯醚萜类。研究表明黄连解毒汤具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗内毒素、改善脑缺血和缺氧、降血糖、调血脂、降胆固醇、逆转细菌及抑制细胞耐药性、保护心肌、保护肠黏膜、保肝、增强免疫、抗肿瘤、镇痛、治疗神经退行性病变等多方面作用［1～8］。黄连解毒汤水提液进一步加工而成的黄连解毒汤配方颗粒中栀子苷、黄芩苷、盐酸巴马汀与盐酸小檗碱的含量较高，为主要的活性成分，因此，测定这4种成分含量对黄连解毒汤配方颗粒的质量控制具有重要的意义。目前，采用HPLC法测定黄连解毒汤中各有效成分的文献报道较多，但多数的色谱分离效果较差或检测时间较长，本文拟探索建立一种同时测定黄连解毒汤配方颗粒中4种主要有效成分含量的方法，并对黄连解毒汤配方颗粒与传统汤剂成分及含量初步比较，为临床应用黄连解毒汤配方颗粒提供理论依据。

1　仪器与试药

1.1仪器：Agilent高效液相色谱仪、BS110S万分之一天平（赛多利斯）、BS200S-WEI千分之一天平（赛多利斯）、xP26百万分之一天平（METTLER TOLEDO）、WS28型恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）。

1.2试药：栀子苷（批号：110749-201316，含量以97.5%计）；黄芩苷（批号：110715-201318，含量以93.3%计）；盐酸巴马汀（批号：110732-201309，含量以86.6%计）；盐酸小檗碱（批号：110713-201212，含量以86.7%计）均购自中国药品生物制品检定所；黄连、黄芩、黄柏、栀子药材均购自广州市药材公司，经魏梅副主任中药师鉴定均为正品；黄连解毒汤配方颗粒，由广东一方制药有限公司生产；乙腈（色谱纯）；水为纯净水，其他试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件：色谱柱：菲罗门Gemini 5u C18110A（250mm× 4.6mm，5μm）柱；流动相：以乙腈为流动相A，以每100mL水中含1mL pH=6.0的醋酸-醋酸铵缓冲溶液为流动相B，梯度洗脱，0～25min，10%～26%A；25～34min，26%～36%A；34～39min，36%A；检测波长：260nm；柱温：30℃；体积流量：1mL/min；进样量：10μL。

2.2混合对照品溶液的制备：精密称取栀子苷对照品3.253mg、黄芩苷对照品1.949mg、盐酸巴马汀对照品0.345mg及盐酸小檗碱对照品2.882mg，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1mL含栀子苷126.87μg、黄芩苷72.74μg、盐酸巴马汀11.95μg、盐酸小檗碱99.95μg的混合对照品溶液。

2.3供试品溶液与阴性样品溶液的制备：取黄连解毒汤配方颗粒0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液5mL置25mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，即得。

采用上述黄连解毒汤配方颗粒的制备方法分别制备缺黄芩阴性样品、缺栀子阴性样品和缺黄连、黄柏阴性样品，按供试品溶液的制备方法，分别制备阴性样品溶液。

2.4醋酸-醋酸铵缓冲溶液的制备：取醋酸铵100g，加水300mL，冰醋酸7mL，摇匀，即得。

2.5专属性试验：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果样品中栀子苷、黄芩苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱都能较好分离，阴性样品无干扰，理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000，见图1。

2.6线性关系考察：分别精密吸取混合对照品溶液1、2、4、8、12、14、16μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录各色谱峰峰面积，以峰面积积分值对各成分含量进行回归处理，求得栀子苷、黄芩苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱标准曲线方程及相关系数，结果见表1。

表1　四种成分的回归方程、相关系数和线性范围

2.7精密度实验：分别精密吸取含栀子苷、黄芩苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录栀子苷、黄芩苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰面积。结果显示四种成分峰面积的RSD分别为1.04%、0.67%、0.50%、0.62%。实验结果表明，仪器精密度较好。

2.8稳定性实验：取供试品溶液按“2.1”项下色谱条件，分别于0、1、2、4、8、12h进样测定，记录栀子苷、黄芩苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰面积。黄连解毒汤配方颗粒中栀子苷、黄芩苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱峰面积的RSD分别为1.92%、1.00%、1.10%、1.06%。实验结果表明，供试品溶液在12h内稳定。

2.9重复性实验：取黄连解毒汤配方颗粒适量，研细，取约0.3g，精密称定，共6份，置具塞锥形瓶中，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定样品中栀子苷、黄芩苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的含量。6份黄连解毒汤配方颗粒中栀子苷、黄芩苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的含量分别为35.97mg/g、56.72mg/g、8.96mg/g、54.24mg/g，RSD分别为 0.91%、1.03%、0.76%、0.71%，实验结果表明，此含量测定方法重复性较好。

2.10加样回收实验：取已知含量的黄连解毒汤配方颗粒适量，研细，取约0.15g（含量：栀子苷35.97mg/g、黄芩苷56.72mg/g、盐酸巴马汀8.96mg/g、盐酸小檗碱54.24mg/g），精密称定，共6份，置具塞锥形瓶中，精密加入栀子苷、黄芩苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱混合对照品溶液（甲醇溶解，浓度分别为0.4523mg/mL、0.7008mg/mL、0.1086mg/mL、0.6700mg/mL）12mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果此含量测定方法回收率较好，四种成分平均回收率分别为103.42%、97.40%、98.05%、95.99%，RSD为1.49%、2.13%、0.80%、0.81%，结果见表2。

表2　黄连解毒汤配方颗粒4种成分加样回收率结果

2.11样品含量测定：分别制备6批黄连解毒汤颗粒剂供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，采用外标法计算黄连解毒汤颗粒剂中4种成分含量，实验结果见表3。

表3　黄连解毒汤颗粒剂中4种成分的含量测定结果（n=6）

3　黄连解毒汤配方颗粒与传统汤剂的比较

3.1传统汤剂样品的制备：按处方取药材饮片共30g（1剂处方量），按《医疗机构中药煎药室管理规范》［9］操作，加10倍量水浸泡30min，加热至沸，保持微沸30min，趁热过滤；药渣加8倍量水二煎，加热至沸后，保持微沸30min，趁热滤过，合并滤液，定容至1000mL作为传统汤剂。

3.2黄连解毒汤配方颗粒样品的制备：取黄连解毒汤配方颗粒7.50g（相当1剂处方量），加热水溶解，定容至1000mL。

3.3黄连解毒汤配方颗粒与传统汤剂样品色谱图谱与含量的比较：精密吸取上述样品溶液各5mL，精密量取25mL，蒸干，残渣甲醇溶解，转移至50mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液，精密吸取10μL，按“2.1.1”项下色谱条件进样，对二者的色谱图进行比较，并对样品液中4种成分的含量进行测定，见图2与表4。

表4　黄连解毒汤配方颗粒与传统汤剂样品的4种成分含量的比较（n=3±s）

表4　黄连解毒汤配方颗粒与传统汤剂样品的4种成分含量的比较（n=3±s）

样品　栀子苷mg·mL-1黄芩苷mg·mL-1盐酸巴马汀mg·mL-1盐酸小檗碱mg·mL-1传统汤剂　1.06±0.05　1.69±0.09　0.26±0.03　1.63±0.07配方颗粒　1.01±0.06　1.57±0.13　0.34±0.08　1.76±0.11

4　讨　论

本研究采用梯度法，在同一色谱条件下测定了黄连解毒汤配方颗粒中栀子苷、黄芩苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱4种成分的含量，色谱图基线平稳，4种成分能较好分离，相关峰分离度均大于1.5，在39min内4种成分能达到完全分离，大大缩短了分析时间，提高了分析效率，可用于黄连解毒汤配方颗粒有效成分含量的快速检测。

黄连解毒汤配方颗粒主要含有环烯醚萜类、黄酮类和生物碱类3类成分。其中，栀子苷属环烯醚萜类，极性较大；黄芩苷属黄酮类（弱酸性），极性较小；盐酸巴马汀和盐酸小檗碱属于生物碱类（弱碱性），常以季铵盐的形式存在，对流动相pH的轻微变化反应极为敏感。3类成分的理化性质差别较大，很难在等度洗脱条件下实现同时分离。本研究参考有关文献［10～12］，比较了乙腈-水流动相中不同浓度的磷酸-三乙胺、乙腈-磷酸缓冲盐流动相中不同浓度三乙胺对黄连解毒汤配方颗粒HPLC分析的影响，结果两种色谱系统均未能很好地将盐酸巴马汀与盐酸小檗碱分离，试验中发现不同比例的乙腈和不同pH值的流动相对4种成分的保留时间及其相邻峰的分离度有不同程度的影响，通过尝试乙腈-乙酸铵缓冲盐系统，发现在此色谱系统条件下，能够改善生物碱类物质的峰形，减少色谱拖尾及基线漂移，能将盐酸巴马汀与盐酸小檗碱很好地分离。

本研究对黄连解毒汤配方颗粒与传统饮片汤剂中栀子苷、黄芩苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱等主要色谱峰进行比较分析，色谱峰峰形基本相似，主要峰的保留时间相同，试验结果表明，黄连解毒汤配方颗粒中的栀子苷、黄芩苷、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱含量与传统汤剂相当，从而为黄连解毒汤配方颗粒替代传统饮片提供了理论依据。

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Simultaneous Detection of the Contents of four Components in HuangLian Jiedu Decoction Compound granules by HPLC and compared with the traditional decoction

Huo Wenjie Du Lanzhe Li Hui Guan Yonghe Zhao Jinghua Chen xiangdong（Guangdong Yi Fang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Foshan 528244，China）

Objective：To establish a method of HPLC which can simultaneously detect the contents of four components in cluding geniposide，baicalin，palmatine，berberine in HuangLian Jiedu decoction granule，and compare the main chromatographic peaks between HuangLian Jiedu Decoction Compound granules and the traditional decoction．Methods：The samples were separated by a Phenomenex C18column（250mm×4.6mm，5μm）with a linear gradient elution under predetermined procedures．Additionally，with acetonitrile as mobile phase A，acetate-containing 1mL PH=6.0 per 100mL of water ammonium acetate buffer solution as mobile phase B，at a flow rate of 1.0mL·min-1．The column temperature was set at 30℃．The eluate was detected at the wavelength of 260nm．Results：Four active components mentioned above in HuangLian Jiedu decoction Formula Granule were completely separated within 39 minutes by the method of HPLC．The regression model suggested a sound linear correlation between the peak areas of four components and corresponding contents.And the average recovery rate（n=6）of the markers listed above ranged from 95.02%to 104.57%．All the relative standard deviations were Less than3.0%．and the main chromatographic peaks of HuangLian Jiedu Decoction Compound granules were the same as the traditional decoction．Conclusion：The method of HPLC was convenient and accurate to detect the contents of three active components in Bazheng decoction Formula Granule simultaneously，the main chromatographic peaks of HuangLian Jiedu Decoction Compound granules were the same as the traditional decoction，which is valuable for HuangLian Jiedu Decoction Compound granules to replace the traditional decoction.

Huanglianjiedu decoction Formula Granule HPLC Content detection Traditional decoction

R284.1

A

1672-8351（2016）02-0010-03

佛山市科技创新专项资金项目（2013GQ100032）