基于HPLC指纹图谱的不同产地金银花—银黄颗粒的质量评价

乔卫林　彭丽华　王慧玲　刘星云（中山市中智药业集团有限公司　中山　528437）

基于HPLC指纹图谱的不同产地金银花—银黄颗粒的质量评价

乔卫林彭丽华王慧玲刘星云（中山市中智药业集团有限公司中山528437）

目的：建立3个不同产地金银花—银黄颗粒的HPLC指纹图谱，评价不同产地金银花及其制剂—银黄颗粒的成分差异。方法：采用高效液相色谱法，Poroshell 120 EC-C18色谱柱（4.6mm×150mm，2.7μm），以乙腈-0.2%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为0.8mL·min-1，检测波长为238nm，柱温为40℃。结果：建立了10批不同产地金银花药材的HPLC指纹图谱共有模式，获得19个共有特征峰；建立了3个不同产地金银花制备的银黄颗粒的HPLC指纹图谱共有模式，获得19个共有特征峰；3个不同产地金银花及其制备银黄颗粒的成分质量相似性较好，但仍存在一定的地域差异。结论：建立的方法稳定、可靠、重复性好，可用于金银花及其制剂—银黄颗粒的质量控制和综合评价。

金银花 银黄颗粒 指纹图谱

银黄颗粒组方由金银花和黄芩构成，具有清热疏风、利咽解毒的功效，用于外感风热、肺胃热盛所致的咽干、咽痛、喉核肿大、口渴、发热，急慢性扁桃体炎、急慢性咽炎、上呼吸道感染等症。该复方主要原料金银花为忍冬科植物忍冬（Lonicera Japonica Thunb.）的干燥花蕾或带初开的花，主产于山东、河南和河北等地。目前，银黄颗粒及金银花药材的质量为通过2个指标成分的含量测定控制［1～5］，但中药发挥药效的物质基础并非仅来源于几个指标成分，指标成分的含量控制无法全面反映中药的内在质量。中药HPLC指纹图谱技术被认为是当前能较全面反映中药材及复方整体化学成分信息的方法，能更有效地评价中药的质量信息。金银花及银黄颗粒各自的指纹图谱研究已有少量报道［6～12］。本研究在分析上述研究背景的基础上，收集来源于不同产地的10批金银花，并制成银黄颗粒成品，再采用HPLC法同时建立金银花药材和相应批次银黄颗粒的指纹图谱，评价不同产地金银花的化学成分差异及对其制剂-银黄颗粒的成分影响。

1　仪器与材料

1.1仪器：安捷伦1200RRLC快速液相色谱仪（美国安捷伦公司）；明澈TM-D24UV纯水系统（美国密理博公司），KQ-400KOE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温水浴锅DK-S24（上海森信实验仪器有限公司）；万分之一电子天平AB204-S（瑞士梅特勒-托利多公司）、十万分之一电子天平AUW220D（日本岛津公司）。

1.2试药和试剂：乙腈、甲醇（HPLC级，天津市彪仕奇科技发展有限公司），AR甲醇、AR无水乙醇（广东光华化学厂有限公司），冰醋酸AR（天津市富宇精细化工有限公司），超纯水（明澈TM-D24UV纯水系统制备）、金银花药材共10批，经中山市中智药业集团有限公司贾世清中药师鉴定为忍冬科植物忍冬（Lonicera Japonica Thunb.）的干燥花蕾，批号及产地信息见表1。银黄颗粒由中山市恒生药业有限公司中试生产。

1.3对照品：绿原酸对照品（110753-200703）、木樨草苷对照品（111720-200905）、咖啡酸对照品（110885-200102）、芦丁对照品（100080-200707）、槲皮素对照品（100081-200907），均购自中国药品生物制品检定所。

2　方法与结果

2.1色谱条件：Poroshell 120 EC-C18色谱柱（4.6mm×150mm，2.7μm）；流动相为乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脱程序见表2；柱温为40℃；检测波长为238nm；流速：0.8mL·min-1；进样量5μL。

表1　金银花及银黄颗粒样品信息

表2　流动相梯度洗脱程序

2.2对照品溶液的制备：精密称定绿原酸、木樨草苷、咖啡酸、芦丁和槲皮素对照品适量，甲醇溶解，配成浓度分别为0.0168mg/ mL、0.0172mg/mL、0.0228mg/mL、0.0324mg/mL和 0.0294mg/mL的对照品混合溶液。

2.3供试品溶液的制备

2.3.1金银花药材供试品溶液的制备：取金银花药材（粉碎，过四号筛）1.0g，置具塞锥形瓶中，精密称定，加入甲醇25mL，超声提取30min（功率500W，频率40kHz），放冷，过滤，将过滤所得残渣继续加甲醇25mL，超声提取30min，过滤，合并滤液，将滤液蒸干，用甲醇定容至10mL，0.22μm微孔滤膜滤过，备用。

2.3.2银黄颗粒供试品溶液的制备：取银黄颗粒4.4g，精密称定，研细，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50mL，超声提取40min（功率500W，频率40kHz），放冷，过滤，将滤液蒸干，用甲醇定容至10mL，0.22μm微孔滤膜滤过，备用。

2.4方法学考察

2.4.1精密度试验：取金银花药材（批号：20100101）1份，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录图谱。各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜1.66%（参照物为绿原酸），表明仪器精密度良好，符合指纹图谱技术要求。

2.4.2重复性试验：取同一批次金银花药材（批号：20100101）6份，精密称定，分别按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录图谱。各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，RSD＜2.78%（参照物为绿原酸），表明本方法的重复性符合指纹图谱控制技术的要求。

2.4.3稳定性试验：取同一批次金银花药材（批号：20100101），精密称定，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，室温下放置。分别于0h、2h、8h、12h、24h、48h内测定，记录图谱。计算48h内各图谱中主要色谱峰峰面积和相对保留时间的RSD。结果各主要色谱峰峰面积和相对保留时间RSD＜2.78%，表明供试品溶液在48h内性质稳定。

2.5指纹图谱的建立及分析

2.5.1参照色谱峰的确定，精密吸取金银花对照药材供试品溶液（批号121060-200805）及混合对照品溶液5μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，见图1。其中供试品图谱中绿原酸峰峰形好，分离度好，选为参照峰。

2.5.2不同产地金银花指纹图谱的建立及比较分析：取上述10批次金银花药材，分别按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，分别进样5μL，按“2.1”项下色谱条件进行分析，记录指纹图谱（见图2）。采用中南大学与中智药业集团联合开发的中药指纹图谱数据库软件，中位数法建立10批次指纹图谱共有模式，共19个共有特征峰，共有特征峰的总面积占总峰面积的90%以上（见图3）。9批不同产地金银花的指纹图谱与对照药材指纹图谱比较，全谱相似度均在0.86以上，但峰面积相似度未全部高于0.85（见表3）。

表3　10批金银花相似度比较

2.5.3银黄颗粒指纹图谱的建立及分析：将不同产地的9批金银花按照银黄颗粒法规工艺制备成9批成品，再分别按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样5μL，按“2.1”项下色谱条件进行分析，记录指纹图谱，分别形成河北金银花所制备银黄颗粒、河南金银花所制备银黄颗粒和山东金银花所制备银黄颗粒的共有图谱（分别命名为YH1、YH2、YH3），进行比较分析（见图5），并分别对比分析不同产地银黄颗粒与其对应的金银花原料指纹图谱相关性（见图6）。采用中药指纹图谱数据库软件，中位数法建立9批银黄颗粒指纹图谱共有模式，共19个共有特征峰，共有特征峰的总面积占总峰面积的90%以上（见图7）。3产地金银花所制备银黄颗粒指纹图谱比较（设河北产金银花所制备银黄颗粒共有图谱为标准图谱），全谱相似度均在0.97以上，但峰面积相似度偏低（见表4）。

表4　3产地金银花所制备银黄颗粒相似度比较

3　讨　论

3.1不同产地金银花指纹图谱数据分析：由表3可见，与金银花对照药材相比，河北和河南产金银花的全谱相似度较高，达0.91，分别可与对照药材形成29个共有峰和27个共有峰，山东产金银花的相似度则相对较低（与对照药材形成19个共有峰）；峰面积相似度比较可见，河南金银花与对照药材更接近。

从绿原酸的含量角度分析，相同生药量浓度下，绿原酸的峰面积大小为金银花对照药材＞河北金银花＞河南金银花＞山东金银花。

为更清晰比较不同产地间金银花药材的差异，对每个产地金银花指纹图谱的共有模式进行对比分析（见图4）。由图4可见：在保留时间为2.6～3.2min之间有2组色谱峰，河北金银花含量显著高于其他产地及对照药材；在保留时间为5.2～5.6min之间有2组色谱峰，河北金银花和对照药材含量显著高于河南金银花和山东金银花；保留时间为6.6min的色谱峰，河南金银花和对照药材含量显著高于河北金银花和山东金银花；山东金银花和河北金银花的咖啡酸含量高于对照药材和河北金银花；山东金银花在保留时间为 12.0～13.5min、16.0～16.5min和19.5min时，存在色谱峰含量极低甚至缺失。

基于上述成分分析的结果，初步认为：①河北和河南产金银花的质量与金银花对照药材更接近，稍优于山东产金银花。②若需简单、快速地鉴别金银花药材产地，河北产金银花的主要鉴别点在保留时间为2.6～3.2min、5.2～5.6min和12.10min处，河南产金银花的主要鉴别点在保留时间为6.6min和7.7min处，山东产金银花的主要鉴别点在保留时间为12.0～13.5min、16.0～16.5min和19.5min处。

3.2银黄颗粒指纹图谱数据分析：由图5可见，不同产地金银花制备的银黄颗粒间存在的成分差异与金银花原料间的差异一致。由图6可见，金银花药材的绝大部分成分峰在制备的银黄颗粒图谱中能找到，说明在制备银黄颗粒过程中，金银花的成分组成是基本稳定的。银黄颗粒图谱中，在保留时间为21.0～28.0min处存在几个金银花药材没有的色谱峰，主要由黄芩药材提供。由表4可见，不同产地金银花制备的银黄颗粒全谱相似度高，但峰面积相似度偏低，认为整体成分组成差异不大但成分含量存在较大的差异，还需结合精确含量测定确认。

3.3本研究对供试品制备的提取溶剂（不同浓度乙醇和甲醇）、提取方法（超声提取、加热回流）、提取时间（20min、30min、40min、60min）和提取次数等均进行了比较研究。结果表明：“2.3”项下条件所制备供试品的指纹图谱干扰峰相对较少，峰信息较全，含量较高，故选其作为供试品制备方法。

3.4本研究采用DAD检测器在200～400nm范围内进行了扫描，结果在238 nm波长下各峰分离良好，峰分布均匀且基线平稳，峰信息量较大，故选取238nm作为指纹图谱检测波长。此外考察了不同色谱柱（Diamonsil C18，4.6mm×250mm，5μm；Hypersil C18，4.6mm×250mm，5μm；Poroshell 120 EC-C18，150mm×4.6mm，2.7μm；ZORBAxEclipsePlusC18，4.6mm×100mm，1.8μm；ZORBAx C18，4.6mm×50mm，1.8μm），不同流动相（乙腈-水，甲醇-水，乙腈-0.1%醋酸，甲醇-0.1%醋酸，乙腈-0.2%磷酸），不同洗脱梯度和不同柱温（25℃、30℃、40℃）的分离效果，结果以“2.1”项下色谱条件所得图谱干扰小、峰形好、峰分离度大，适合作为金银花及银黄颗粒HPLC指纹图谱分析的色谱条件。

3.5本研究分析的金银花样品批次有限。还需进一步扩大收集不同产地的金银花批次量并制备成相应批次的银黄颗粒，从而建立不同产地金银花的指纹图谱模型，确认更清晰的指纹图谱鉴别点，并反映不同产地原料和生产工艺等环节的差异对银黄颗粒成品质量差异的影响。

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HPLC fingerprints of Lonicera Japonica Thunb.—Yinhuang Granules from different habitats

Qiao Weilin Peng Lihua Wang Huiling Liu xingyun（Zhongshan City，China Pharmaceutical Group Co.，Ltd.Zhongshan 528437）

Objective：To establish HPLC fingerprint of Lonicera Japonica Thunb.—Yinhuang Granules from different habitats and evaluate their differences.Methods：RP-HPLC was performed on an Poroshell 120 EC-C18column（4.6mm×150mm，2.7μm）with a gradient elution composed of acetonitrile-aqueous solution containing 0.2%phosphoric acid at the flow rate of 0.8mL·min-1.The column temperature was set at 40℃，while the detective wavelength was set at 238nm.Results：The chromatographic fingerprint common pattern of Lonicera Japonica Thunb.was established and 19 mutual peaks were obtained from the chromatograms of 10 batches of samples；The chromatographic fingerprint common pattern of Yinhuang Granules was established and 19 mutual peaks were obtained.The quality of Yinhuang Granules andLonicera Japonica Thunb.from different habitats was similar but there were still some regional differences. Conclusion：The method has good precision，stability and repeatability and can be used for quality control for Lonicera Japonica Thunb. andYinhuang Granules.

Lonicera Japonica Thunb Yinhuang Granules Fingerprint

R284.1

A

1672-8351（2016）02-0005-03