基底膜染色方法比较及在胃粘膜异型增生与胃腺癌中的应用

郑 伟胡志坚张春梁林建忠林少敏

（福建医科大学1病理学系，2公共卫生学院，3药学院，福州 350004）



基底膜染色方法比较及在胃粘膜异型增生与胃腺癌中的应用

郑 伟1*胡志坚2张春梁1林建忠3林少敏1

（福建医科大学1病理学系，2公共卫生学院，3药学院，福州 350004）

目的 探讨胃粘膜上皮基底膜有效、便捷、直观的实验方法，及基底膜、Ki67免疫组织化学、粘液多重染色在胃腺癌组织染色中的可行性。方法 用过碘酸希夫（periodic acid Schiff，PAS）反应、六胺银法（methenamine silver method，PASM）、网状纤维染色、苦味酸-天狼猩红（Picrosirius red，SR）和IV型胶原免疫组织化学5种染色方法对多种胃粘膜异型增生及胃腺癌病理标本基底膜进行染色，并利用Friedman检验、Wilcoxon检验定量分析、比较基底膜阳性区域面积。此外，在同一张胃腺癌组织切片上进行显示基底膜、蛋白质、粘液的多重染色。结果 5种基底膜染色方法中，IV型胶原免疫反应阳性面积与SR染色阳性面积（胃粘膜中-重度异型增生标本除外）无显著性差异、PAS与PASM染色阳性面积无显著性差异、网状纤维染色阳性面积最大。多重染色实验结果显示胃腺癌Ki-67、阿尔新蓝（Alcian blue，AB）-PAS二重染色和Ki-67、AB、SR三重染色，分别显示对应结构，效果良好。结论 观察基底膜，胃粘膜中-重度异型增生标本中IV型胶原免疫组织化学与SR染色要分别选用；胃粘膜轻度异型增生及胃腺癌标本中IV型与SR染色可相互替代；PAS与PASM染色法可相互替代，我们推荐较为便捷的SR和PAS染色；网状纤维染色观察比较直观，可选用。此外，SR、PAS也可分别应用于胃腺癌Ki67免疫组织化学与AB的多重染色中，效果良好。

异型增生；胃腺癌；基底膜；定量分析；多重染色

在胃粘膜异型增生、胃腺癌的临床检验与研究中，基底膜形态的改变及表达程度、细胞增殖指数（ki-67）、p53蛋白的检出率、粘液的性质等常是关注点［1-3］。特殊染色和免疫组织化学法在病理辅助诊断中有其独特优势。实践中，基底膜可以用多种染色方法显示，包括过碘酸希夫（periodic acid Schiff，PAS）反应、六胺银法（methenamine silver method，PASM）、网状纤维染色、苦味酸-天狼猩红（Picrosirius red，SR）法和IV型胶原免疫组织化学法。有的特殊染色一种方法可以显示多种目的物。本文结合定量分析对胃粘膜异型增生—癌演进中基底膜的不同染色方法进行了比较，同时在实验中通过多重染色把基底膜与上述关注点聚焦在同一张切片上，使其形态学间相互比较更加直观，从而为胃粘膜异型增生—癌演进中的病理辅助诊断与实验研究提供有效、便捷、直观的方法。

材料和方法

1 临床资料

收集福建医科大学病理学系及附属第一医院病理科2011年1月～2014年3月的胃粘膜活检组织40例，临床病例资料完整的、经手术切除的胃腺癌30例，其中异型增生轻度20例，中-重度20例，中分化腺癌15例，低分化腺癌15例。女27例，男43例，年龄36～82岁。病理诊断经2位以上经验丰富的病理医师阅HE染色切片证实。

2 主要试剂和方法

PAS、PASM、网状纤维染色液和SR液，由福建医科大学病理学系配制［4-6］。鼠抗人单克隆抗体Ⅳ型胶原（克隆号：PHM-12）、鼠抗人单克隆抗体Ki-67（克隆号：SP6）、ElivisionTMplus试剂盒（鼠/兔）（Kit-9902）和DAB Kit（20×）购自福州迈新生物技术有限公司。

2.1 基底膜特殊染色

每例石蜡组织均取4μm连续切片5张，4张分别做PAS、PASM、网状纤维和SR染色［4］，一张备用（做IV型胶原免疫组织化学检测），正常胃组织作对照。

2.2 IV型胶原免疫组织化学染色

抗IV型胶原（Collagen IV）抗体为即用型抗体，按ElivisionTMplus/HRP免疫组织化学操作步骤进行。

2.3 不同染色阳性区域面积测量

PAS、PASM、网状纤维染色、IV型胶原免疫组织化学染色切片分别置于20倍普通光学显微镜下、SR染色切片置于20倍数的偏光显微镜下观察，对每例切片所测相同区域进行定位后，提取图像，输入“Image Plus”彩色图像分析系统，准确分割阳性区域，尺寸定标后，测量该区域的面积。

2.4 免疫组织化学、基底膜、粘液、胶原多重染色

在同一张胃粘膜异型增生或胃腺癌4μm切片上进行多重染色：第1重染色按ElivisionTMplus试剂盒对Ki-67（核阳性）进行免疫组织化学染色，DAB显色后，自来水冲洗10min，蒸馏水洗。第2重染色，行AB-PAS显示酸性粘液、中性粘液和基底膜［4］，切片水洗后经蒸馏水洗。第3重染色，如果第2重染色只染AB，则这一步可用SR显示胶原纤维和肌组织。切片脱水、透明、中性树脂封固。

3 统计学处理

数据采用中位数和四分位数间距进行统计描述（资料不服从正态分布），应用Friedman检验各组间的差异，并用Wilcoxon进行两两比较，检验水准α= 0.05，所有数据采用SPSS17.0进行统计分析。

结 果

1 异型增生胃粘膜基底膜阳性区域面积5种染色方法比较

对异型增生胃粘膜中基底膜阳性区域面积中位数测量（表1）显示，网状纤维染色法最大，PAS、PASM法偏小。对5种染色方法进行两两比较，结果胃粘膜轻度异型增生组的SR与IV型胶原免疫组织化学染色之间、PAS与PASM之间无显著性差异；胃粘膜中-重度异型增生组中，PAS与PASM染色之间无显著性差异；其余各组两两比较均有显著性差异。

表1　异型增生胃粘膜基底膜阳性区域面积百分位数值5种染色方法比较（单位：μm2）Table 1 Comparisons between percentile values of gastric dysplasia basement membrane positive area generated by 5 staining methods（unit：μm2）

2 胃腺癌基底膜阳性区域面积5种染色方法比较

测量胃腺癌基底膜阳性区域面积中位数（表2）显示，网状纤维染色法最大，PAS、PASM法偏小。5种染色方法两两比较，胃中分化腺癌组与胃低分化腺癌组，SR与IV型、PAS与PASM，均无显著性差异；其余各组两两比较均有显著性差异。

表2　胃腺癌基底膜阳性区域面积百分位数值5种染色方法比较（单位：μm2）Table 2 Comparisons between percentile values of gastric adenocarcinoma basement membrane positive area generated by 5 staining methods（unit：μm2）

3 胃组织基底膜、网状纤维、Ⅳ型胶原纤维等成分5种不同染色方法比较

图1　不同染色方法显示胃组织基底膜、网状纤维、Ⅳ型胶原纤维等成分。A，PAS染色，中性粘液、基底膜呈红紫色（箭头），细胞核蓝色；B，PASM染色，中性粘液、基底膜呈黑色（箭头），细胞核蓝色；C，网纤染色，网状纤维、基底膜呈黑色（箭头）；D，SR染色（偏光显微镜下），Ⅳ型胶原纤维呈浅黄色（箭头）；E，Ⅳ型胶原纤维免疫组化染色，Ⅳ型胶原纤维呈棕黄色（箭头），细胞核蓝色；比例尺，100μmFig.1 Different staining methods showed that the basement membrane，reticular fiber，type IV collagen fiber in gastric tissue. A，PAS staining，the neutral mucus of gastric mucosa and the basement membrane showed red and purple（arrow），the nucleus showed blue；B，PASM staining，the neutral mucus of gastric mucosa and the basement membrane showed black（arrow），the nucleus showed blue；C，reticular fiber staining，the reticular fiber and the basement membrane showed black（arrow）；D，SR staining（by polarizing microscope），TypeⅣcollagen fiber showed light yellow（arrow）；E，Type IV collagen immunohistochemical staining，TypeⅣcollagen fiber showed brown yellow（arrow），the nucleus showed blue；Scale bar，100μm

胃粘膜上皮基底膜完整、呈线型，中-重度异型增生的部分基底膜可呈片段型，形成细小分支伸向固有层；胃腺癌的基底膜可出现厚薄不一、不连续、中断或者消失等不规则现象。PAS染色显示，胃粘膜中性粘液、基底膜呈红紫色，细胞核蓝色（图1A）；PASM染色显示，胃粘膜中性粘液、基底膜呈黑色，细胞核蓝色（图1B）。以上两种染色基底膜、中性粘液同时呈色，要注意区别。网状纤维染色显示，网状纤维、基底膜呈黑色（图1C）。SR染色（偏光显微镜下）显示，胃组织中I型胶原纤维呈亮红色，Ⅲ型胶原纤维呈绿色，Ⅳ型胶原纤维呈浅黄色（图1D）。SR染色在偏光显微镜下，可以区分各型胶原纤维。Ⅳ型胶原纤维免疫组织化学染色显示，胃组织中Ⅳ型胶原纤维呈棕黄色，细胞核蓝色（图1E）。

4 胃腺癌组织Ki-67、AB-PAS二重染色和Ki-67、 AB、SR三重染色效果比较

Ki-67、AB-PAS染色可见Ki-67阳性表达定位于细胞核显棕褐色（DAB显色），胃粘膜中性粘液、基底膜呈红色、酸性粘液呈蓝色（图2A）。Ki-67、AB、SR三重染色可见Ki-67阳性表达定位于细胞核显棕褐色，胃粘膜酸性粘液呈绿色，胶原纤维呈红色（在偏光显微镜下，可观察Ⅳ型胶原纤维），肌纤维呈黄色（图2B）。以上两组多重染色，各成分染色表达清晰，互不干扰且色彩有反差。

图2　胃腺癌组织免疫组织化学、粘液、胶原多重染色。A，Ki-67免疫组织化学与AB-PAS双重染色，Ki-67阳性核显棕褐色（☆），中性粘液呈红色（※），酸性粘液呈蓝色（△）；B，Ki-67免疫组织化学、AB与SR三重染色，Ki-67阳性核显棕褐色（☆），酸性粘液呈绿色（△），胶原纤维呈红色（◇），肌纤维呈黄色（箭头）；比例尺，100μmFig.2 Multiple staining of proteins，mucus and fiber in gastric adenocarcinoma.A，double stains of Ki-67-immunohistochemistry and AB-PAS，Ki-67 positive nucleus stained brown（☆），the neutral mucus of gastric mucosa stained red（※），and the acid mucus stained blue（△）；B，triple stains of Ki-67-immunohistochemistry，AB and SR，Ki-67 positive nucleus stained brown（☆），the acid mucus of gastric mucosa stained green（△），collagen fibers stained red（◇），and muscle fibers stained yellow（arrow）；scale bar，100μm

讨 论

在胃上皮异型增生-癌演进中，HE染色切片上很难甚至不可能观察出瘤细胞“突破基底膜”现象。胃上皮异型增生是否直接导致形态学意义上的浸润癌，也少有文献报道［7］。便捷、直观地显示基底膜形态的改变，以及不同性质的粘液和某些蛋白标志物的表达，为上述演进过程中的辅助诊断与实验研究，提供有效的方法。基底膜是高度有序的特化的细胞外基质，呈致密的、薄层状结构，厚度约40～120nm不等。基底膜位于上皮细胞和内皮细胞的基底部，将细胞与结缔组织隔离，是肿瘤细胞浸润和转移的自然屏障。基底膜的成分包括Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、内联蛋白等，它们对维持基底膜结构的完整性起着重要作用［8］。

5种染色方法对基底膜阳性区域面积进行的定量分析中，经Friedman检验各组间的差异，并两两方法比较（Wilcoxon检验），结果IV型胶原免疫反应阳性面积与SR染色阳性面积（4组中有3组，胃粘膜中-重度异型增生标本除外）、PAS与PASM染色阳性面积（4组）无差异。中位数值，各组中网状纤维染色阳性面积最大。

Ⅳ型胶原是构成基底膜的主要成分之一［8］，分布于腺体周围、血管壁等部位，在腺体周围形成完整均匀连续的线状结构。经SR染色后，在偏光显微镜下观察，各型胶原显出不同色彩，清楚可辨，Ⅳ型胶原纤维，呈浅黄色。相比而言，免疫组织化学检测Ⅳ型胶原所用抗体、试剂盒等较贵，操作费时；而SR试剂直接染色，操作简便。这两种方法有3组二者结果无差异，可选择使用试剂少、步骤简捷、费用经济的SR染色法。SR法在配制苦味酸-天狼猩红液时，苦味酸一定要过饱和，否则着色不良。本实验胃粘膜中-重度异型增生组，Ⅳ与SR方法有显著差异，提示高级别异型增生组实验，SR与Ⅳ型胶原纤维免疫组化法要同时选用。

PAS与PASM染色，可以着染粘蛋白，粘蛋白是由多糖与蛋白质结合的复合物，在基底膜中存在粘蛋白成分。这两种方法，同时也使胃腺体中的中性粘多糖着色。本实验可见PAS与PASM法，染色阳性面积结果无差异。PASM法需在六胺银中加温染色，因是进行性银浸染，经常要取出用蒸馏水洗后在显微镜下观察染色效果，以免着色不够或过染。有报道PASM用于肾小球基底膜的染色，但染色质量不易控制［9］。相比较PAS法Schiff试剂在室温下染色，如果过染，亚硫酸冲洗液对避免假阳性出现有一定的作用，该技术较好控制、相对简便。PAS法在配制Schiff试剂时，偏重亚硫酸钠的质量一定要纯，碱性品红有不同的厂牌和批号，纯度较高的可以少加活性炭，配制中所用的玻璃器皿要求十分干净［5］。

网状纤维主要成分是胶原蛋白，它的原纤维上包有一层特殊糖蛋白，据称这是导致它有嗜银性的原因［4］。在胃粘膜上皮，网状纤维单独存在，没有网状细胞伴随，胃腺体上皮的基底膜物质，可被网状纤维法银染。该染色技术是银氨液浸染法，本实验采用酸化高锰酸钾增强氧化，暴露更多的醛基，使网状纤维的染色加强，背景更为清晰；使用的氢氧化银氨液是银氨液中最易被还原，容易和目的物结合的一种（网状纤维染色阳性面积最大）。配好后的银氨液很敏感，宜用棕色玻璃瓶盛装密塞后置4℃的冰箱保存。

在胃腺癌标本中，本系还实验了同一张切片上进行基底膜、蛋白标志物、粘液等多重染色，使各种成分形态学间相互关系更加直观。以上推荐的SR与PAS染色，在Ki-67免疫组织化学（核阳性表达、DAB显色）与AB-PAS双重染色和Ki-67免疫组织化学、AB和SR三重染色中，均达到较好的效果。多重染色的基本原则是，阳性染色表达互不干扰且色彩有反差，利于显微镜下的观察。免疫组织化学和特殊染色组合中，要先进行免疫组织化学显色，然后行特殊染色，经验是染色步骤多的、时间作用久的先进行。同时，也要考虑到染料的分子大小（以分子量作参考），分子小的先染色。主要原因是，分子大的染料与组织着染后，一般会比较紧密，不容易被取代，具体在本实验中，SR中天狼猩红（大分子染料）染色宜在最后进行。另外，与免疫组织化学核阳性的抗体组合，效果比较好，因为基底膜、粘多糖、胶原等成分的特殊染色多定位在细胞质、间质，这样组合对结果判定的干扰比较小。

综上所述，在胃粘膜异型增生、胃腺癌的辅助诊断与实验研究中，胃粘膜中-重度异型增生组，Ⅳ型胶原免疫组化与SR染色要分别选用。其他各组，如果显示基底膜中的Ⅳ型纤维，可选便捷的SR直接染色（偏光显微镜下观察）；PAS方法在显示基底膜中的粘蛋白时比较实用；网状纤维可染色基底膜物质，因含量多，显微镜下观察较为直观。因此观察基底膜推荐SR、PAS与网状纤维染色，为首选方法。另外，多重染色的应用，蛋白质、基底膜、粘液、胶原纤维聚焦在同一张切片上，形态学间相互关系一目了然，有利于直观判断与比较。

［1］黎进，马炬明.基质金属蛋白酶-2、9在胃癌中的研究进展.中国肿瘤，2015，24（5）：403-407.

［2］李慧，时阳，孙逊等.胃腺癌组织中P53、Ki-67的表达及其临床意义。中国老年学杂志，2013，33（2）：275-277.

［3］金银姬，金晓明，姜洋等.胃黏液癌黏液成分的判定与浸润转移的相关性研究.哈尔滨医科大学学报，2006，40（2）：103-106.

［4］梁英杰，凌启波，张威.临床病理学技术.北京：人民卫生出版社，2011，96-98，225-226，239-240.

［5］郑伟，杨美容.不同方法配制希夫试剂的染色效果.福建医科大学学报，2001，35（2）：168.

［6］郑伟.苦味酸天狼猩红染色在心脏胶原纤维定量分析中的应用.福建医科大学学报，1999，33（2）：225.

［7］李凯，唐志鹏，戴彦成.胃上皮异型增生的新概念.世界华人消化杂志，2007，15（11）：1181-1184.

［8］周晋，陈奕，丁健.基底膜和肿瘤转移.生理科学进展，2006，37（4）：307-312.

［9］田玉旺，李琳，朱红艳，等.提高肾小球基底膜PASM染色法质量的技巧.中国组织化学与细胞化学杂志，2010，19（3）：313-314.

Comparison between different staining methods of basement membrane and their application in gastric epithelial dysplasia and gastric adenocarcinoma

Zheng Wei1*，Hu Zhijian2，Zhang Chunliang1，Lin Jianzhong3，Lin Shaomin1
（1Department of pathology，2College of public health，3College of pharmacy，Fujian medical university，Fuzhou 350004，China）

Objective To explore effective，convenient and intuitive experimental methods for the study of gastric epithelial basement membrane，and investigate the feasibility of multiple staining-basement membrane，Ki67 immunohistochemistry and mucus -for gastric adenocarcinoma.Methods We stained the basement membrane of gastric epithelial dysplasia and gastric adenocarcinoma specimens with 5 methods:PAS，PASM，Reticular fiber staining，SR，and IV collagen immunohistochemistry.Friedman and Wilcoxon tests were used for quantitative analysis and comparison of the positive area of basement membrane.Besides，we conducted multiple staining for basement membrane，protein and mucus on the same slice of gastric adenocarcinoma.Results Among the 5 staining methods，IV and SR（except for the group of moderate to severe dysplasia in gastric mucosa），PAS and PASM showed no difference.The reticular fiber staining showed the highest content of basement membrane.The double staining of Ki67 and AB-PAS and the triple staining of Ki-67，AB and SR in gastric adenocarcinoma showed good results in reflecting respective structures.Conclusion For the observation of basement membrane in gastric mucosa specimens of moderate to severe dysplasia，IV collagen immunohistochemistry and SR staining should be chosen.For the other groups，either IV or SR，and either PAS or PASM can be used，but SR and PAS are more effective and convenient.The reticular fiber staining is more intuitive，which is also recommended.Besides，in multiple staining experiments of gastric adenocarcinoma，SR and PAS can be used with Ki67 immunohistochemistry and AB respectively，with good results.

dysplasia；gastric adenocarcinoma；basement membrane；quantitative analysis；multiple staining

R329 R322.44

A

10.16705/j.cnki.1004-1850.

2015-08-15 〔修回日期〕2016-03-24

郑伟，男（1968年），汉族，高级实验师

（To whom correspondence should be addressed）：zhengw2005@126.com