miR-505-3p对GT1-7细胞株基因表达谱的影响

仝 莉李 雨王茂春周宇荀肖君华*

（1东华大学环境科学与工程学院，2东华大学化学化工与生物工程学院，上海 201620）



miR-505-3p对GT1-7细胞株基因表达谱的影响

仝 莉1李 雨2王茂春2周宇荀2肖君华2*

（1东华大学环境科学与工程学院，2东华大学化学化工与生物工程学院，上海 201620）

目的 了解微小RNA 505-3p（miR-505-3p）对下丘脑GnRH神经元GT1-7稳转细胞株表达谱的影响。方法 用慢病毒转染GT1-7细胞获得稳定表达miR-505-3p的细胞株，感染实验分为3组：空白对照组（未经处理的GT1-7细胞），阴性对照组（感染pLenti6.3-nc空病毒），实验组（感染pLenti6.3-miR-505-3p病毒）。采用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）技术检测稳定细胞株中miR-505-3p的表达丰度，并进一步利用芯片检测对照组和实验组细胞的表达谱结合生物信息学方法探寻差异表达基因。采用GO分析和Pathway分析差异表达基因，解析miR-505-3p的功能。结果 在稳定表达miR-505-3p的GT1-7细胞中，165个基因的表达量变化在2倍以上，这些基因主要参与细胞粘附、GTP分解代谢、神经系统发育等生物过程。结论 miR-505-3p可能通过影响下丘脑GnRH神经元中相应靶基因的表达调控细胞粘附、GTP分解代谢、神经系统发育等生物过程，和间隙连接、轴突导向和胃酸分泌等信号通路。

miR-505-3p，GT1-7细胞，表达谱，GO分析，KEGG分析

微小RNA（miRNA）是一类平均长度19-24bp的保守非编码RNA，是一种重要的调控因子，可通过结合靶基因的3'非编码区影响mRNA的翻译和稳定性［1］。每一个 miRNA可以调节几十甚至上百个基因，最终可以有效调控多个细胞通路。通过协调多个基因的表达，miRNA参与各种生物学过程，包括细胞生长、增殖、分化和胚胎发育。因此，miRNA表达异常会导致许多病理生理学的反应，比如免疫反应、炎症反应、衰老、癌症和心血管疾病［2，3］。

小鼠miR-505位于X染色体小鼠miR-505基因位于X染色体（物理位置60392403-60396492），其初级体90bp，前体56bp。成熟体的miR-505分为miR -505-3p（图1）和miR-505-5p。成熟体包括miR-505-3p（图1）和miR-505-5p。已知miR-505-3p可以诱导小鼠胚胎成纤维细胞的衰老和凋亡［4］，同时是人类原发性胆汁肝硬化［5］和高血压［6］的生物学标记。另外，作为一种肿瘤抑制因子，miR-505-3p通过抑制人乳腺癌上皮细胞的增殖实现肿瘤的抑制［7］。本实验室前期研究发现，miR-505-3p可以显著抑制小鼠性发育的启动，提示miR-505-3p可能对性发育启动的关键神经元——促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）神经元中的基因起到重要调控作用。

GnRH神经元是控制性发育启动的主要神经元，下丘脑GnRH神经元适时激活决定性发育和成年个体的繁殖能力。但由于GnRH神经元在动物体内数量很少，且分布散在，所以GnRH神经元的研究变得十分困难［8］。1990年，Pamela L.Mellon等从转基因小鼠下丘脑肿瘤细胞中分离出能稳定分泌促性腺激素释放激素（GnRH）的细胞株，并命名为GT1-7细胞。GT1-7细胞具有高度分化的GnRH神经元的特征，其表型形态、超微结构、基因表达以及激素储存和分泌方式与GnRH细胞完全一致，且能在体外分裂传代［9-10］，因此GT1-7细胞是研究GnRH神经元的理想细胞模型。

本研究拟通过构建miRNA-505-3p的GT1-7细胞的稳转株，探讨miR-505-3p对GT1-7细胞表达谱的影响，并通过后续的生物信息学分析找到miR-505-3p调控的生物学过程和信号通路，为后期解析miR-505-3p的功能，建立动物模型奠定细胞学基础。

图1　小鼠miR-505-3p初级体发夹结构。红色部分为成熟的miR-505-3pFig.1 Stem-loop structure of mouse primary miR-505-3p.The red part represents the sequence of mature miR-505-3p

材料和方法

1 细胞株

小鼠GT1-7细胞株，由复旦大学吴晓晖教授惠赠。

2 主要试剂

Trizol（TaKaRa公司，大连）；逆转录试剂盒RevertAid First strand cDNA synthesis kit，（Thermo，美国）；DNaseI（Thermo，美国）；DMEM高糖培养基（HyClone，美国）、胎牛血清（Gibco，美国）；PBS、胰酶、青霉素链霉素混合液（上海宁盛生物科技有限公司）；杀稻瘟菌素（Invitrogen，美国）；聚凝胺（Sigma，美国）。

3 实验仪器

PCR仪、CO2恒温培养箱BB15型（Thermo，美国）；NanoDrop微量紫外分光光度计2000型（Thermo，美国）；Real-Time PCR仪7500型（Applied Biosystems Inc.，美国）；倒置相差显微镜I×70型（OLYMPUS，日本）；台式高速冷冻离心机（Thermo，美国）。

4 筛选建立稳定过表达miR-505-3p的GT1-7细胞株

4.1 感染目的细胞

慢病毒干扰载体由上海英潍捷基公司（Invitrogen）构建。慢病毒载体为pLenti6.3/V5-DEST，插入的绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）和miR-505-3p在CMV启动子的控制下可以普遍表达，并且该慢病毒具有杀稻瘟菌素抗性基因。得到慢病毒干扰载体后，由和元生物技术（上海）股份有限公司进行病毒包装，得到的病毒颗粒滴度为2.83E+08。

感染前2d，胰酶消化GT1-7细胞并计数细胞密度，按照4×104个/孔细胞密度接种至24孔板，加入DMEM完全培养液，10%FBS，置于37℃、CO2体积分数为5%饱和湿度培养箱中培养；培养48 h，融合度达到50%～70%后，在含有病毒的培养液中加入聚凝胺（工作液浓度为6μg/ml），促进病毒感染细胞；感染实验分为3组：空白对照组（Blank，未经处理的GT1-7细胞），阴性对照组（pLenti，转染pLenti6.3空病毒），miR-505-3p过表达组（pLanti-miR，转染pLenti6.3-miR-505-3p病毒）；吸去细胞的培养液后，加入含有不同浓度病毒的完全培养液500 μL，病毒的感染复数（multiplicity of infection，MOI）从10～100。培养18h后，吸去细胞中含有病毒的培养液，加入1ml新鲜的完全培养液，继续在培养箱中培养。

4.2 筛选GT1-7细胞

GT1-7细胞分别在含有0、1、1.5、2.5、3.5、5和6μg/ml杀稻瘟菌素（blasticidin）的DMEM，10%FBS培养10-14d，隔天更换一次筛选培养基，以最低细胞全部死亡浓度为杀稻瘟菌素最佳筛选浓度。培养10d后将杀稻瘟菌素浓度减半，维持筛选压力。筛选约14d后可见有抗性克隆出现。将克隆放大培养后，在荧光显微镜下观察，发现所有细胞都表达绿色荧光蛋白，则筛选结束。得到的细胞用来提取总RNA来进行miR-505-3p的检测。

5 miR-505-3p表达量检测

5.1 RNA抽提

细胞按1×106密度接种于六孔板培养，待细胞长满后吸去上清，用预冷的PBS洗3次后，每孔加入1ml Trizol，抽提细胞总RNA。取2μl至分光光度计检测纯度和浓度，1μl进行琼脂糖电泳检测其完整性，余下部分立即保存于-80℃超低温冰箱中，或立即用于反转录反应。

5.2 DNaseI处理

用DNaseI消化抽提的RNA中的痕量基因组DNA污染。DNaseI消化反应体系为RNA 1μg、10× Reaction Buffer 1μl、DNaseI（1U/μl）1μl，补水至10μl。反应过程为20℃15min，然后加1μl EDTA（25mmol/L），65℃ 10min使DNase I失活。

5.3 茎环引物的逆转录反应

总RNA中包含miR-505-3p的初级体、前体和成熟体，其内在的同源性增加了对miR-505-3p的成熟体检测的复杂性。本实验室采用茎环引物对成熟的微小RNA进行逆转录，并结合SYBR-Green qRTPCR技术对其进行定量分析，研究结果已发表在Molecular Biotechnology杂志上［11］。除此之外，本研究选取miR-16-5p为看家基因。逆转录茎环引物序列见表1。

表1　qRT-PCR中所用引物序列Table 1 Sequences of primers used in qRT-PCR

5.4 qRT-PCR反应体系和条件

用于实时荧光定量PCR的引物序列见表1。RT-PCR反应终体系20μl包括：10μl2×SYBR Green PCR master mix，0.4μlROX，2.5μLcDNA模板，3μlPCR上下游引物（2μmol/L），4.1μl水，同时设阴性对照。PCR循环条件为95℃预变性2min，95℃变性15s，62℃延伸32s，共40个循环，每个样本做3个重复。反应的特异性通过产物溶解曲线以及1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测进行确认。经SDS2.2软件分析循环域值（CT值）。

5.5 qRT-PCR数据分析

6 GeneChip Mouse Transcriptome Assay 1.0检测及数据分析

6.1 基因芯片检测

同上法抽提RNA后，将标本委托上海其明信息技术有限公司进行基因表达谱的检测，结果用Affymetrix公司的Transcriptome Analysis Console（TAC） Software进行分析。

6.2 GO分析

将两组之间的差异基因基于GO数据库进行基因功能注释，得到基因参与的所有功能，而后利用Fisher精确检验和多重比较检验计算每个功能的显著性水平（P-value）和误判率（FDR）。从而筛选出差异基因所体现的显著性功能，显著性筛选的标准：P＜0.05。

6.3 Pathway分析

基于KEGG数据库，对差异基因利用Fisher精确检验和卡方检验，把目标基因参与的Pathway进行显著性分析，按照P＜0.05进行筛选，得到显著性的Pathway。

结 果

1 稳定表达miR-505-3p的GT1-7细胞差异表达基因

将GT1-7感染病毒后经杀稻瘟菌素筛选，得到稳转miR-505-3p的GT1-7稳转细胞株。由于慢病毒载体中含有绿色荧光蛋白基因，因此，阴性对照组和过表达miR-505-3p的GT1-7细胞在显微镜下发出强烈的绿色荧光（图2）；野生型GT1-7细胞呈现典型的GnRH神经元形态，在荧光显微镜下没有荧光；在阴性对照组和miR-505-3p过表达组中，虽然细胞形态和野生型GT1-7保持一致，但每个细胞都发出强烈的绿色荧光。实时定量PCR检测显示，过表达miR-505-3p的GT1-7稳转株细胞中miR-505-3p的表达量显著高于空白对照和阴性对照细胞（图3）。

图2　稳定表达miR-505-3p的GT1-7细胞株。Blank，空白对照组；pLenti，阴性对照组；pLenti-miR-505-3p，过表达miR-505-3p组；Phase，倒置相差显微镜图像，荧光显微镜图像；比例尺，25μmFig.2 Stable transfected miR-505-3p in GT1-7 cell line.Blank，control group（untreatment），pLenti，negative control group，pLenti-miR-505-3p，miR-505-3p-over-expression group.Phase，inverted phase microscopic images；Flu，fluorescence microscopic images；scale bar，25μm

图3　稳定表达miR-505-3p的GT1-7细胞株中miR-505-3p表达水平的实时荧光定量PCR检测。Blank，空白对照组；pLenti，阴性对照组；pLenti-miR-505-3p，过表达miR-505-3p组；*，P＜0.01Fig.3 Expression level of miR-505-3p in miR-505-3p stably transfected GT1-7 with qRT-PCR.Blank，control group；pLenti，negative control group；pLenti-miR-505-3p，miR-505-3p-over-expression group；*P＜0.01

为了明确miR-505-3p对GT1-7细胞的表达谱产生的影响，我们对pLenti-nc和pLenti-miR505-3p两组细胞的RNA样本进行表达谱芯片的检测。在研究两组样本基因表达差异时，选择表达量相差2倍以上的基因为差异基因（图4）。当在GT1-7细胞中过量表达miR-505-3p时，有165个基因的表达产生差异。其中，下调倍数较大的基因有Stag3、Cga、Ctse和Vmn1r1，分别下调10.5、5.5、5.5和5.3倍；上调倍数较大的基因有Rgs7bp、Capsl和Mr1，分别上调了6.1、4.3和4.3倍；其他大多数基因的表达量变化都为2～3倍。

图4　稳定表达miR-505-3p的GT1-7细胞差异表达基因的转录组芯片检测。pLenti，阴性对照组；pLenti-miR-505-3p，过表达miR-505-3p组Fig.4 Transcriptome assay test of differential expression genes in miR-505-3p stably transfected GT1-7 cell line.pLenti，negative control group；pLenti-miR-505-3p，miR-505-3p-over-expression group

2 稳定表达miR-505-3p的GT1-7细胞差异表达基因的功能

为了进一步研究miR-505-3p在神经元细胞株GT1-7中的功能，我们用Gene Ontology（GO）分析将两组之间的差异基因基于GO数据库进行基因功能注释，筛选出差异基因所体现的显著性功能。结果显示，miR-505-3p调控的基因主要参与细胞粘附、GTP分解代谢、神经系统的发育等生物过程（图5）。在过表达miR-505-3p的GT1-7细胞中，参与调控细胞粘附过程的差异较大的基因有Ddr2、Cdh10、Pcdhb15等，它们分别上调3.03、2.99和2.75倍；参与GTP分解代谢的基因中，表达量变化较大的有Rasd1、Tuba4a，它们分别变化3.24和2.7倍；参与神经系统发育过程的基因中变化较大的有Dscam和Ntrk，它们分别上升2.63和2.57倍。

此外，我们进一步研究了miR-505-3p高表达影响的信号通路（图6）。在前20个显著差异的信号通路中，差异最显著的是调控间隙连接、轴突导向和胃酸分泌的信号通路。参与缝隙连接的基因中表达量变化较大的有Adcy8和Gnai1基因，分别上调了3.09和2.58倍；参与轴突导向信号通路的基因中，表达量变化较大的有Gnai1和Srgap3基因，分别上调2.58和2.42倍；参与胃酸分泌信号通路的基因中，表达量变化较大的有Adcy8和Gnai1，它们分别上调3.09和2.58倍。其中，基因Adcy8和Gnai1都参与了显著性最高的三个信号通路，并且在参与通路的基因中变化幅度较大。

图6　差异表达基因参与的前20个最显著的信号通路。纵坐标代表基因参与的信号通路名称，横坐标代表P值，（P＜0.05，5%FDR）Fig.6 The top 20 significant signaling pathways of the differentially expressed genes.The vertical axis is the pathway category and the horizontal axis is the P-value，（p＜0.05，5%FDR）

讨 论

近年来，在神经系统中发现了大量的miRNAs，这些miRNAs在神经系统中大量表达，并且对于神经元的生长发挥着重要的作用。性发育由GnRH神经元控制，GnRH神经元脉冲性地释放GnRH激素是性发育启动的标志性事件。本实验室前期工作发现miR-505-3p可以显著抑制小鼠性发育启动，提示miR-505-3p可能对GnRH神经元中相应的基因起到调控作用。所以本文在永生化的GnRH神经元GT1-7细胞中用慢病毒转染的方法过表达miR-505-3p，研究其对GT1-7基因表达谱的影响，并通过生物信息学分析的手段提示可能影响的生物学过程和信号通路。

当在GT1-7细胞中过表达miR-505-3p时，GT1-7细胞中有165个基因的表达量改变了两倍以上，其中表达量差异最大的基因为Stag3。这个基因已经被证明和雄性不育［12］及原发性卵巢发育不全密切相关［13］。当我们对差异基因进行KEGG信号通路分析时，发现性发育相关的重要信号通路例如GnRH信号通路、GABA能突触信号通路和胰岛素分泌信号通路都受到了显著的调控，由此提示miR-505-3p确实可以对GnRH神经元的性发育相关的基因起到调控作用，但是miR-505-3p的具体作用机制仍需进一步的研究。

除此之外，在已有的报道中，miR-505-3p已经被证明是一种肿瘤抑制因子，它可以通过抑制人乳腺癌上皮细胞的增殖实现肿瘤的抑制［14］；与此同时，它还可以诱导小鼠胚胎成纤维细胞的衰老和凋亡［4］。而且，miR-505-3p还是人类原发性胆汁肝硬化［15］和高血压［16］的生物学标记。因此对miR-505-3p的研究具有重要意义。

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Expression Patterns of GT1-7 Cell Line Affected by miR-505-3p

Tong Li1，Li Yu2，Wang Maochun2，Zhou Yuxun2，Xiao Junhua2*
（1Institute of Biological Sciences and Biotechnology，Donghua University，2College of Chemistry，Chemical Engineering&Biotechnology，Donghua University，Shanghai 201620，China）

Objective To understand the effect of miR-505-3p on the expression pattern of stability GT1-7 cell.Methods The GT1-7 cells were divided into 3 groups:control group（untreated），negative control group（infected with pLenti6.3-nc lentivirus），experimental group（infected with pLenti6.3-miR-505-3p lentivirus）.The miR-505-3p expression level was detected by quantitative Real-time PCR（qRT-PCR）.Then we used the GeneChip Mouse Transcriptome Assay 1.0 to detect the expression pattern of the stably transfected cell lines，GO analysis was used to analyze the main function of the differential expression genes according to Gene Ontology，and Pathway analysis was used to find out the significant pathways of the differential genes according to Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）.Results Compared with those in the negative control group，165 genes were regulated in the experimental group，which participated in some important biological processes such as cell adhesion，GTP catabolic process，and nervous system development.Conclusion Through its target genes，miR-505-3p can regulate such biological processes as cell adhesion，GTP catabolic process，and nervous system development，and such pathways as for gap junction，axon guidance，and gastric acid secretion.

miR-505-3p，GT1-7 cell，expression pattern，GO analysis，KEGG analysis

R394.3

A

10.16705/j.cnki.1004-1850.

2016-01-20 〔修回日期〕2016-04-20

上海市动管基金（13140900300），东华大学研究生创新基金（12D11321）

仝莉，女（1988年），汉族，博士

（To whom correspondence should be addressed）：xiaojunhua@dhu.edu.cn