微小染色体维持蛋白2在鼻咽癌中的免疫组织化学表达及临床意义

潘素明杜日昌彭淑平*李桂源*

（1中南大学肿瘤研究所，长沙 410078；2广东粤北人民医院病理科，韶关 512025）



技术方法

微小染色体维持蛋白2在鼻咽癌中的免疫组织化学表达及临床意义

潘素明1杜日昌2彭淑平1*李桂源1*

（1中南大学肿瘤研究所，长沙 410078；2广东粤北人民医院病理科，韶关 512025）

目的 研究微小染色体维持蛋白2（MCM2）在鼻咽癌中表达以及同鼻咽癌临床分期、颈淋巴结转移、病理类型、远处转移等的关系。方法 对62例鼻咽癌标本应用免疫组化法研究、分析MCM2基因的表达情况。结果 ①有远处转移组的MCM2表达水平明显高于无远处转移组；②MCM2的表达水平与临床分期呈正相关；③MCM2表达在未分化癌组中高于角化性鳞癌组；④MCM2的表达在有无颈淋巴结转移、年龄、性别组间无明显差异。结论 MCM2表达的程度与鼻咽癌的临床分期相关；MCM2的高表达可能是鼻咽癌远处转移的因素之一；MCM2表达的水平可能是鼻咽癌预后评估的重要参考指标。

微小染色体维持蛋白2；鼻咽癌；远处转移

鼻咽癌起病隐匿，容易发生区域淋巴结转移和远处转移［1］，随着综合治疗技术的进步、设备的更新和临床诊疗的水平提高，鼻咽癌的临床疗效大大提高，强调放疗的应用，让鼻咽癌3年局部控制率提高至90%以上，但远处转移仍然是鼻咽癌治疗失败的主要原因［2-5］。所以，提前预判鼻咽癌患者远处转移的风险，并有针对地按患者个体情况来选择合适的治疗方案，这对提高患者的临床疗效有着重要意义。肿瘤的转移是由多因素、多步骤和多基因共同作用而成的一个复杂过程，有很多方面的原因。肿瘤最基本的生物学特征为失控性生长，即过度增殖。近年来，微小染色体维持蛋白家族因其在DNA复制的起始、延伸和细胞的异常增殖及肿瘤的发生过程相关连，所以目前已被认为是反映细胞增殖的一项重要指标。微小染色体维持蛋白2（mini chromosome maintenance protein 2，MCM2）是该家族中的一员，在人类多种肿瘤组织中表达，应用MCM2检测可反应MCM蛋白的水平［6，7］。本研究旨在通过研究MCM2在鼻咽癌组织中的表达，分析MCM2与肿瘤临床特征之间的关系，探究MCM2在鼻咽癌中的临床价值。

材料和方法

1 研究对象

回顾性收集2012年1月至2014年12月在广东省粤北人民医院确诊的431例鼻咽癌患者的资料。符合以下标准的患者入组：①首程治疗经鼻咽部活检病理学明确诊断为鼻咽癌，并经胸片、腹部B超、骨ECT、PET-CT等辅助检查排除骨、肺、肝等远处转移；②首程治疗按计划完成根治性放疗；③在根治性放疗后发生远处转移时，根据鼻咽纤维镜检查、鼻咽+颈部MRI扫描排除鼻咽及颈部淋巴结复发。共31例符合入组标准的患者纳入本研究，卡氏评分均≥80。其中男19例，女12例；年龄17～78岁，中位年龄45岁。另随机选出31例未远处转移病例作对照。按中国鼻咽癌2008临床分期：I期1例，II期16例，III期30例，IV期15例；病理分型：非角化癌58例，角化型鳞癌4例。

2 免疫组织化学染色

选取患者鼻咽活检后存档的石蜡标本进行切片，采用EnVision二步法进行免疫组织化学染色检测组织中MCM2的表达情况。抗MCM2单克隆抗体购自美国abcam公司，工作浓度1：100，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固，用PBS替代一抗作为阴性对照。

3 结果判定与统计学方法

低倍镜下选择5个阳性细胞最密集、背景最清晰区域，每个区域在高倍镜下计数100个细胞中阳性细胞数，取5个区域阳性细胞数的平均值作为结果计数，并进行半定量分级：阳性细胞0%～5%为（-），阳性细胞6%～25%为（+），阳性细胞 26%～50%为（++），阳性细胞51%～75%为（+++），阳性细胞76%～100%为（++++）。根据文献［8］报道进一步将其分为高表达组，即阳性细胞＞25%（++～++ ++），低表达组，即阳性细胞≤25%（-～+）。

采用SPSS17.0软件对有转移和无转移鼻咽癌中MCM2免疫组织化学表达水平进行Mann-Whitney检验，对MCM2的表达与各临床病理参数之间的关系进行χ2检验。

结 果

1 MCM2在有转移的鼻咽癌中高表达

免疫组织化学检测显示，在有转移组中，MCM2免疫反应阴性（图1A）及低水平（+）（图1B）表达病例少于无转移组，而高水平（++～++++）表达（图1C、图1D、图1E）病例明显多于无转移组（表1）。31例有远处转移组患者中26例MCM2呈阳性表达，阳性率83.9%，无转移组中MCM2表达阳性率71.0%，Mann-Whitney检验显示，有转移组MCM2表达（秩均值为36.18）高于无转移对照组（秩均值为26.82）（表1）。

表1　有转移与无转移鼻咽癌中MCM2表达比较Table 1 Comparsion of MCM2 expression in nasopharyngeal carcinoma with or without metas

2 鼻咽癌中MCM2表达与临床参数的关系

MCM2表达在不同年龄、性别及在有、无淋巴结转移组中差异无统计学意义（P＞0.05）。在III+IV期中MCM2表达高于I+II期，差异有统计学意义（χ2=7.351，P=0.007）。在未分化癌中MCM2表达高于角化性鳞癌，差异也存在统计学意义（χ2= 3.955，P=0.047）（表2）。

表2　鼻咽癌中MCM2免疫组织化学表达与各临床参数的关系Table 2 The relationships of MCM2 immunohistochemical expression and clinical parameters in nasopharyngeal

图1　有远处转移鼻咽癌MCM2表达的免疫组织化学染色。A，MCM2免疫反应阴性；B，MCM2低表达（+）；C，MCM2高表达（++）；D，MCM2高表达（+++）；E，MCM2高表达（++++）；比例尺：A1、B1、C1、D1和E1，1500μm；A2、B2、C2、D2和E2，400μm。Fig.1 Immunohistochemical staining of MCM2 expression in patients with distant metastasis of nasopharyngeal carcinoma.A，MCM2 immunoreactivity was negative；B，MCM2 expression（+）；C，MCM2 expression（++）；D，MCM2 expression（+++）；E，MCM2 expression（++++）；scale bar：A1，B1，C1，D1 and E1，1500μm；A2，B2，C2，D2 and E2，400μm

讨 论

细胞异常增殖是肿瘤发生、发展的核心环节，而细胞增殖决定细胞周期，细胞周期受DNA复制的调控，因此检测DNA复制起始的相关蛋白可预测肿瘤发生。临床中发现许多与细胞增殖有关的生物标志物可以指导患者的预后［9-11］。Ki-67是目前临床最常用的细胞增殖标志物，其高表达是多种恶性肿瘤的预后不良因素［10，12］。但Ki-67能否成为鼻咽癌的特异性预后指标，目前仍存争议。Ki-67参与核糖体的生物合成，并不直接参与细胞增殖［13］，因此我们认为，直接参与DNA复制和细胞周期调控的分子，可能较Ki-67更特异性地指导预后。细胞周期的调控机制复杂，有多种基因和蛋白参与，其中微小染色体维持蛋白（MCMs）是重要的DNA复制启动因子。MCM2是其家族的一员，MCM2在细胞处于静止期及分化成熟期含量较少，在转化、增殖的细胞中，MCM2含量不断改变，从G0期开始增加，到G1末期和S早期达到高峰，并与染色质结合，在S期至M期成为游离的MCM2，G2期与M期降低。这种与细胞增殖过程一致的周期性变化，目前已将它作为S细胞的标记物［14］，并被看成是特异性增殖相关因子癌前标记［15］。

大量文献报道，MCM2在各种肿瘤细胞中出现高表达［16-18］。MCM2在食管鳞癌中的表达与淋巴转移、组织分级、病理分期等有关［19］；MCM2在胃癌阳性表达与患者的T分期和区域淋巴结转移相关［20］。本研究发现在鼻咽癌有远处转移组患者中MCM2呈阳性表达阳性率83.9%，无转移组中MCM2表达阳性率71.0%，差异具有统计意义（Z=2.086，P=0.037）提示鼻咽癌中MCM2高表达可能是远处转移的危险因素。且发现未分化癌中MCM2表达高于角化性鳞癌，差异有统计学意义。表明MCM2的表达能够较好地反映细胞的过度增生和异常分化。此外，III+IV期鼻咽癌中MCM2表达阳性率高于I、II期，提示MCM2表达的程度与鼻咽癌的临床分期有关，MCM2高表达与鼻咽癌发生、发展密切相关。

关于鼻咽癌颈淋巴结的转移与增殖标志物之间的关系，大部分学者认为目前临床最常用的增殖标志物Ki67表达与鼻咽癌颈淋巴结转移有关，鼻咽癌有颈淋巴结转移者Ki67的表达率高［21］。目前未见有MCM2表达在这方面的研究报导。有研究发现在乳腺癌、胃癌中局部淋巴结的转移者MCM2表达率高［22，23］。但本组资料显示MCM2的表达与有无颈淋巴结转移在统计学上无明显差异。可能有下列原因：①采集的病例数不足够多；②有远处转移患者在研究总病例中占有一半的比例；③其他未知原因。MCM2的表达与有无颈淋巴结转移无关，但与临床分期有关，是因为总分期更能反应肿瘤的特性。

总之，本研究发现在鼻咽癌有远处转移组患者中MCM2阳性表达阳性率增高，提示MCM2的高表达时其癌组织的生物学行为较为凶险，转移风险高。MCM2的高表达可能是鼻咽癌的远处转移的因素之一；MCM2表达的程度可能是鼻咽癌预后评估的重要参考指标。我们还需加大样本量，进行相关研究，保证结果的可靠。

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Immunohistochemical expression of mini chromosome maintenance protein 2 in nasopharyngeal carcinoma and its clinical implications

Pan Suming1，Du Richang2，Peng Shuping1*，Li Guiyuan1*
（1Cancer Research Institute，Central South University，Changsha 410078；2Department of Pathology，Yue Bei People's hospital of Guangdong province，Shaoguan 512025，China）

Objective To study the correlations of the immunohistochemical expression of mini chromosome maintenance protein 2（MCM2）in nasopharyngeal carcinoma with clinical stage，cervical lymph node metastasis，pathological type and distant metastasis.Methods The expression of MCM2 gene was studied in 62 cases of nasopharyngeal carcinoma by immunohistochemistry.Results①The expression level of MCM2 in primary nasopharyngeal carcinoma with distant metastasis was higher than in that without distant metastasis.②MCM2 expression was positively correlated with clinical stage.③MCM2 expression in anaplastic carcinoma was higher than in keratinizing squamous cell carcinoma.④MCM2 expression showed no significant differences regarding age，gender，and cervical lymph node metastasis.Conclusion MCM2 expression is associated with the clinical stage of nasopharyngeal carcinoma.The increased expression of MCM2 may be one of the factors for distant metastasis of nasopharyngeal carcinoma.The degree of MCM2 expression may be an important reference index for the prognosis evaluation of nasopharyngeal carcinoma.

Mini Chromosome Maintenance Protein 2；nasopharyngeal carcinoma；distant metastasis

R33

A

10.16705/j.cnki.1004-1850.

2016-01-18 〔修回日期〕2016-04-11

潘素明，男（1973年），汉族，主任医师

（To whom correspondence should be addressed）：shuping@csu.edu.cn；lgy@csu.edu.cn