骨骼肌钝挫伤恢复过程中HIF-1α、AMPKα2表达的改变*

温 含，葛新发，Δ，董贵俊，庞洪波，张力辉

骨骼肌钝挫伤恢复过程中HIF-1α、AMPKα2表达的改变*

温 含1，葛新发1，2Δ，董贵俊2，庞洪波3，张力辉4

（1.上海体育学院 ，上海200438；2.山东体育学院 ，济南250102；3.天津市残疾人康复服务指导中心 ，天津300381；4.河北港口集团有限公司港口医院 ，秦皇岛066002）

目的:观测大鼠骨骼肌钝挫伤（SMBI）恢复进程中腺苷酸活化蛋白激酶α2（AMPKα2）、缺氧诱导因子-1α （HIF-1α）的表达变化，探讨SMBI恢复可能生物学机制。方法:雄性Wistar大鼠48只，随机选取6只作为正常对照组；另42只大鼠重物砸伤后肢小腿建立钝挫伤模型后分7组（n=6），造模后各组分别在伤后12 h、2 d、5 d、7 d、10 d、15 d、30 d取材，检测小腿三头肌HIF-1α、AMPKα2表达的变化。结果:损伤后12 h HIF-1α、AMPKα2表达均明显升高，在伤后15 d开始回落接近正常；HIF-1α、AMPKα2表达的峰值出现在伤后2 d内，伤后5 d后表达量开始下降；除HIF-1αmRNA在伤后2 d组表达出现峰值外，其余时间点二者mRNA与蛋白表达时程变化基本一致。结论:SMBI后，HIF-1α、AMPKα2可能通过参与调解缺氧适应、肌细胞再生、能量代偿起到促进伤后恢复的作用。

骨骼肌钝挫伤；腺苷酸活化蛋白激酶α2；缺氧诱导因子-1a；线粒体自噬；能量代偿；大鼠

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.018

在运动损伤中SMNI极为常见，如若恢复过程不当、恢复不完全或反复受伤会严重影响骨骼肌的生理功能，造成人体运动能力的下降，甚至影响运动员的运动寿命［1］，其中以股四头肌和腓肠肌的钝挫伤最为常见［2］。有研究发现，有氧代谢能力显著下降是钝挫伤恢复过程中重要影响因素［3］。伤后受损组织由于细胞损坏、血管破损、炎细胞浸润、缺血后再灌注等因素导致局部组织供氧不足，利用氧的能力继续下降，进而能量代谢紊乱，不利于受损部位通过自身循环代谢完成自身免疫、肌纤维再生与重组，从而严重影响损伤后恢复速度［4］。作为细胞能量调节器的腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）和调节缺氧适应能力的重要因子缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）在缺氧、炎症的情况下会积极参与能量代偿的调节与线粒体自噬的发生，故推测二者在SMBI发生后可能参与骨骼肌恢复的能量代偿和缺氧适应。本文通过局部砸伤骨骼肌造模，来证明和探讨所提假设。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

雄性Wistar大鼠48只，体重210～230 g，随机选取6只作为正常对照组；另42只大鼠重物砸伤后肢小腿建立钝挫伤模型后分7组（n=6），造模后各组分别在伤后12 h、2 d、5 d、7 d、10 d、15 d、30 d取材。

1.2 大鼠腓肠肌钝挫伤模型的建立及取材

参考Rice KG［5］等的造模方法，大鼠腹腔注射10 g/L硫喷托纳，麻醉后固定下肢，用木质圆柱体自由下落造成右后肢小腿内侧面（皮下为腓肠肌中段）一次性打击伤。打击面直径110 cm，圆柱体长度20 cm，质量620 g，下落高度40 cm，实际重力为6 108 N，实际动能为2 143 J。造模后伤处肿胀但无出血，伤腿功能受限；处死大鼠发现皮下血肿明显；去骨骼肌做切片HE染色后光镜下观察可见大量肌纤维断裂、完整性缺失，纤维走形混乱，细胞外基质中可见红细胞，证实造模成功。取腓肠肌，冰水中去除凝血块、脂肪和筋膜，锡箔纸包裹标记组别后迅速置入液氮中，后放入-80℃冰箱保存。

1.3 主要仪器、试剂

温控摇床，Powerpac Basic电泳仪，Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System，BIO-RAD ChemiDoc XRS凝胶成像系统，Trizol，SYBRGreenMix，引物，Real-Time PCR仪，ABI，Sep One Plus，各蛋白抗体

1.4 Western blot测定HIF-1、AMPK蛋白

取适量组织于离心管中，加入RIPA裂解液，手动匀浆，冰上放置30min。14 000 r/min离心20min，吸取上清，转移至新离心管中，-80℃保存备用。使用Nanodrop超微量核酸蛋白测定仪进行蛋白定量。100℃煮沸变性5 min。配制10%分离胶凝胶，浓缩胶浓度为4%。电泳条件:浓缩胶恒压80 V，约40 min；分离胶恒压120 V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部。设置恒流300 mA，冰浴转膜2 h。将膜浸没在封闭液Ⅱ中室温轻摇90 min。封闭液，一抗孵育4℃过夜。稀释二抗，目的蛋白用羊抗鼠-HRP 1∶20 000或羊抗兔-HRP 1∶10 000（根据一抗进行选择）室温孵育60min。ECL反应、曝光扫描得到蛋白表达图片及灰度值。

1.5 RT-PCR测定HIF-1α、AMPKα2mRNA

实验条件参考汤强［6］等方法。总RNA的提取: 取100mg骨骼肌加入1ml Trizol液，冰浴磨碎后，加氯仿、异丙醇、酒精等处理提取总RNA。在紫外分光光度下检测波长在260 nm和280 nm吸光度值，分析提取物RNA纯度。制作2%的琼脂糖凝胶，点入RAN样品，60 V电压下电泳30min，电泳后的胶板放入紫外透视仪下观察，要求出现三个条带，并且28 s的条带亮度要高于18 s，说明抽提中没有RNA的明显降解。根据测试的RNA浓度将所有的样品浓度用 Rnase Freewater调整为 1μg/μl。以OligdT（18）为引物反转录（RT）合成cDNA。各目的基因引物见表3，PCR扩增条件:95℃0.5min；95℃5 s，60℃34 s（40个循环）；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。

1.6 数据统计及处理

2 结果

2.1 SMBI后骨骼肌缺氧相关因子 HIF-1α、AMPKα2蛋白表达变化

SMBI恢复过程中，在伤后12 h、2 d取材组HIF-1α、AMPKα2蛋白表达增高非常显著（P＜0.01）。伤后10 d，HIF-1α表达均明显高于对照组（P＜0.05），从伤后15 d起HIF-1α表达接近正常；而AMPKα2仅在伤后5 d表达仍显著高于对照组（P＜0.05），自伤后10 d起，表达回归至正常水平（表1）。

Tab.1 Mean valuesof the expressionsof HIF-1αand AMPKα2 on each time-point（±s，n =6）

Tab.1 Mean valuesof the expressionsof HIF-1αand AMPKα2 on each time-point（±s，n =6）

HIF-1α:Hypoxia inducible factor-1 alpha；AMPKα2:AMP-activated protein kinase alpha 2*P＜0.05，**P＜0.01 vs controlgroup

Group　HIF-1α　AMPKα2 .76±0.05 Control　0.25±0.06　0.77±0.12 12 h　0.44±0.09**　1.05±0.15**2 d　0.43±0.09**　1.06±0.21**5 d　0.34±0.06*　0.94±0.14*7 d　0.29±0.06*　0.81±0.09 10 d　0.26±0.03*　0.75±0.11 15 d　0.258±0.05　0.77±0.09 30 d　0.25±0.02　0

2.2 SMBI后骨骼肌缺氧相关因子 HIF-1α、AMPKα2mRNA表达变化

在SMBI恢复过程中，HIF-1αmRNA在伤后第2天表达出现峰值，与对照组有非常显著性差异（P＜0.01），伤后第5天表达有下降趋势，但仍较对照组有显著升高（P＜0.05），伤后第7天表达回落正常，；而AMPKα2mRNA从伤后12 h表达较对照组有非常显著的升高且达到峰值，该趋势一直延续至伤后第2天，伤后第5天表达虽显著高于对照组，但表达缺呈下降趋势，伤后第7天表达回归正常水平延续至伤后30 d。从趋势上来看，AMPKα2变化趋势与其mRNA表达基本吻合；而伤后12 h骨骼肌中HIF-1α表达量已达峰值，此时其mRNA却仍接近正常，其他时间点蛋白与RNA表现基本一致（表2）。

Tab.2 Mean values of HIF-1αand AMPKα2 on each time-point （±s，n =6）

Tab.2 Mean values of HIF-1αand AMPKα2 on each time-point （±s，n =6）

HIF-1α:Hypoxia inducible factor-1 alpha；AMPKα2:AMP-activated protein kinase alpha two*P＜0.05，**P＜0.01 vs controlgroup

Group　HIF-1α　AMPKα2 Control　0.87±0.15　1.01±0.18 12 h　1.22±0.28　3.46±0.82**2 d　4.73±0.85**　3.29±0.71**5 d　2.23±0.44*　1.49±0.25*7 d　1.02±0.35　1.04±0.30 10 d　1.05±0.29　1.06±0.26 15 d　1.00±0.29　1.02±0.30 30 d　1.04±0.26　1.02±0.27

3 讨论

作为能量调节中心的AMPK近年来一直是能量代谢研究的热点。AMPK不但维持细胞能量的稳定，还在机体对特殊情况产生适应性中发挥重要作用［7-9］。AMPK主要在两种情况下可被激活:（1）AMP/ATP的比值升高时（能量产生不足）；（2）缺氧应激因子脯氨酸羟化酶（PHDs）经AMPK上游激酶（AMPKK）途径激活AMPK［10］。SMBI后，肌组织被破坏，同时出现血管损坏、细胞破损、炎细胞浸润、炎性因子聚集、线粒体肿胀破坏等病理性改变，造成局部供血不足，组织缺血缺氧同时线粒体病变共同导致ATP生成障碍，此时AMP/ATP升高激活AMPK；另外供血不足导致局部组织细胞缺氧环境的形成，可直接通过缺氧应激因子脯氨酸羟化酶（PHDs）经AMPK上游激酶（AMPKK）途径激活AMPK。

作为对缺氧敏感的另一因子低氧诱导因子HIF-1，广泛表达于各组织细胞中，在缺氧应激发生时可促进机体和细胞产生低氧适应。低氧可直接导致HIF-1表达升高，但有观点认为低氧诱导的HIF-1表达改变仅发生在蛋白水平，其mRNA并不发生改变［11，12］，同时大量的炎性因子对HIF-1的聚集、DNA结合活性及下游因子表达也起到明显调节作用［13］。

AMPK作为能量代谢枢纽，在调节体内能量代谢的平衡中扮演了尤为重要的角色，活化的AMPK可激活PGC-1α，PGC-1α能够调控许多细胞核编码的线粒体基因表达，通过PGC-1α-NRFs-Tfam途径启动线粒体的生物发生，在线粒体生物发生过程中起到重要的调控作用［14，15］，为损伤肌纤维补充线粒体数量。活化的AMPK还能通过促进骨骼肌细胞葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）基因的表达来增加肌纤维对糖的摄取。大量实验证明，激活的AMPK通过磷酸化下游靶蛋白来关闭体内合成代谢，增加分解代谢产生ATP。活化的AMPK可激活真核细胞延长因子2 （eukaryote elongation factor，eEf2）上游激酶，从而磷酸化eEf2来抑制蛋白合成［16］，AMPK还可以通过抑制mTOR来抑制蛋白质的合成［17］，从而节省为合成蛋白所消耗的ATP。AMPK由上述原因可促进分解代谢增加，为病理状态下的机体提供能量供应，减少细胞坏死。

HIF-1由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成［18］，其中HIF-1β在大多数细胞中表达稳定，HIF-1α在常氧水平下处于降解与表达的动态平衡［19］。HIF-1α对细胞存活有较强的调控能力，低氧发生时HIF-1可以抑制凋亡分子的活性同时激活抗凋亡分子来调控细胞适应低氧应激，促进细胞存活［20］。HIF-1对细胞低氧的适应性调节是通过调控下游靶基因介导间接的作用。Ono等在观察C2C12细胞在成肌分化过程中HIF-1α变化时分析发现，HIF-1α是C2C12细胞成肌分化所必需的条件［21］。HIF-1α可调控促红细胞生成素，Ogilvie［22］等发现EPO能刺激成肌细胞的增值，可能参与损伤组织的修复过程。

本实验目前从对SMBI的动物模型的建立上来看，与受伤实际情况还有明显差别，损伤分级也并不够明确，这些都有待于进一步完善。

［1］亓建洪.运动创伤学［M］.北京:人民军医出版社，2008:1-2.

［2］Beiner JM，Jokl P.Muscle injuries:current treatment option ［M］.Am Acad Orthop Surg，2001，9（4）:227-237.

［3］Leeder J，Spence J，Taylor E，et al.The effectof electrical stimulation on recovery from exercise-inducedmuscle damage ［J］.Br JSportsMed，2011，45（15）:A21.

［4］董贵俊 ，葛新发，李可峰，等.磁场定位磁纳米化bFGF治疗大鼠腓肠肌钝挫伤恢复效果研究［J］.武汉体育学院学报，2011，45（2）:43-46.

［5］Kenneth G，Rice Jacgueline P，Dellwo.Within-semester stability and adjustment correlates of themultidimensional perfectionism scale［J］.Meas Evalu in Coma Dev，2001，34 （3）:146-156.

［6］汤 强，姜文凯，盛 蕾，等.低氧高强度训练下大鼠骨骼肌糖酵解酶活性和HIF-1α表达的变化［J］.体育与科学，2009，30（2）:62-67.

［7］Hardie，DG，Carling D，Carlson M.The AMP-activated/ SNF1 protein kinase subfamily:Metabolic sensors of the eukaryotic cell［J］.Annu Rev Biochem，1998，67:821-855.

［8］Kudo N，Barr AJ，Barr RL，et al.High rates of fatty acid oxidation during reperfusion of ischemic hearts are associatedwith a decrease inmalonyl-CoA levels due to an increase in 5'-AMP-activated protein kinase inhibition of acetyl-CoA carboxylase［J］.J Biol Chem，1995，270（29）:17513-17520.

［9］Hardie DG，Scott JW，Pan DA，etal.Managementof cellularenergy by the AMP-activated protein kinase system［J］. FEBSLett，2003，54（6）:113-120.

［10］Zhang BB，Zhou G，Li C.AMPK:an emerging drug target for diabetes and themetabolic syndrome［J］.Cell Metab，2009，9（5）:407-416.

［11］Kubis HP，Hanke N，Scheibe RJ，et al.Accumulation and nuclear import of HIF1 alpha during high and low oxygen concentration in skeletalmuscle cells in primary culture［J］. Biochim BiophysActa，2005（2），1745:187-195.

［12］Stroka DM，Burkhardt T，Desbaillets I，et al.HIF-1Αis expressed in normoxic tissue and displaysan organ ic-specific regulation under system in hypoxia［J］.FASEB J，2001，15 （13）:2445-2453.

［13］Sandau KB，Zhou J，Kietzmann T，et al.Regulation of the hypoxia-inducible factor1alpha by the inflammatorymediators nitric oxide and tumornecrosis factor-alpha in contrast to desferroxamine and phenylarsine oxide［J］.JBiolChem，2001，276（43）:39805-39811.

［14］丁 虎 ，刘晓然 ，刘丹霞，等.急性运动诱导大鼠骨骼肌线粒体生物合成:H2O2参与介导PGC-1α转录［J］.中国运动医学，27（2）:136-143.

［15］Hardie DG，Ross FA，Hawley SA.AMP-activated protein kinase:A target for drugs both ancient and modern［J］. Chem Biol，2012，19（10）:1222-1236.

［16］Wang Y，Gao E，Tao L，et al.AMPK-activated protein kinase deficiency enhancesmyocardial ischemia/reperfusion injury but has minimal effect on the antioxidant/antinitrative protection of adiponectin［J］.Circulation，2009，119（6）: 835-844.

［17］Kim AS，Miller EJ，Wright TM，et al.A small AMPK activator protects the heart against ischemia-reperfusion injury ［J］.JMol Cell Cardiol，2011，51（1）:24-32.

［18］Mourorzis I，Giagourta I，Galanopoulos G，et al.Thyroid hormone improves themechanical performance of the post-infarcted diabeticmyocardium:a response associated with upregulation of Akt/mTORand AMPKactivation［J］. Metabolism，2013，62（10）:1387-1393.

［19］LiL，Madu CO，Lu A，etal.HIF-1 alpha promotesahypoxiaindependent cellmigration［J］.Open Biol J，2010，3:8-14.

［20］Yan BC，Park JH，Shin BN，et al.Neuroprotective effectof anew synthetic aspirin-decursinoladduct in experimentalanimalmodels of ischemic stroke［J］.PLoSOne，2013，8（9）: e74886.

［21］Ono Y，SensuiH，Sakamoto Y，etal.Knockdown ofhypoxia-inducible factor-1αby siRNA inhibits C2C1 2 myoblast differentiation［J］.JCell Biochem，2006，98（3）:642-649.

［22］Ogilvie M，Yu X，Nicolas-Metral V，et al.Erythropoietin stimulates proliferation and interferes with differentiation of myoblasts［J］.Biol Chem，2000，275（50）:39754-39761.

The changes of HIF-1αand AMPKα2 exp ression levels during skeletal muscle blunt injury recovery

WEN Han1，GEXin-fa1，2Δ，DONGGui-jun2，PANG Hong-bo3，ZHANG Li-hui4
（1.Shanghai University of Sport，Shanghai 200438；2.Shandong Spot University，Jinan 250102；3.Tianjin Disabled Rehabilitation Center，Tianjin 300381；4.Qinhuangdao Port Hospital of Hebei Port Group Co.，Ltd，Qinhuangdao 066002，China）

【ABSTRACT】Objective:To explore the possible biologicalmechanismsof skeletalmuscle injury recovery by observing the changesof AMP-activated protein kinaseα2（AMPKα2）and hypoxia inducible factor-1α（HIF-1α）expression levels of rats in the skeletalmuscle blunt injury recovery process.Method:Six of the 48maleWistar ratswas randomly selected as the normal controlgroup.The blunt injurymodelwas set up by injuring the hind legs of remaining 42 ratswith heavy objects.Then theywere divided into 7 groups（n=6）.The changes of AMPKα2and HIF-1αexpression levelswere tested in the hind limb triceps surae of themodel rats from each of the 7 groups at 12 hours，2 days，5days，7 days，10 days，15 days and 30 days respectively following the injury.Results:The expression levelsof AMPKα2 and HIF-1αall increased significantly at12 hours following the injury and fell close to normal levels at 15 days following the injury.The valuesof AMPKα2 and HIF-1αexpression peaked within 2 days after injury and the expression levels began to decline at 5 days after injury.Except the peak，the changes of themRNA expressionsof the two proteinswere basically consistentwith those of protein expression at the other time points.Conclu sion:HIF-1αand AMPKα2might play roles inmediating hypoxia adaptation，muscle cell regeneration，and energy compensation to promote recovery after injury.

skeletalmuscle blunt injury； AMPKα2； HIF-1a； mitochondrial autophagy； the energy compensation； mouse

R33

A

1000-6834（2016）03-260-04

山东省自然科学基金资助项目（ZR2012CMO13）；运动健身科技省部共建教育部重点实验室（上海体育学院）资助项目

2015-11-13

2016-02-14

Tel:18553101017；E-mail:gexinfa@163.com