厄贝沙坦对抗糖尿病大鼠心肌纤维化作用及机制*

张冠军，张蔚屏，王开成，于 影，谢雪峰，高 琴△

厄贝沙坦对抗糖尿病大鼠心肌纤维化作用及机制*

张冠军1，2，张蔚屏1，王开成2，于 影1，谢雪峰3，高 琴1△

（1.蚌埠医学院生理学教研室 ，安徽 蚌埠233030；2.无锡市惠山区人民医院 ，江苏无锡214187；3.蚌埠医学院2012级生物科学系 ，安徽 蚌埠233030）

目的:观察厄贝沙坦对抗糖尿病大鼠心肌纤维化的作用，并分析细胞外调节信号激酶（ERK）通路在其中的作用。方法:健康雄性SD大鼠32只，随机分成两组:正常对照组（CON，n=10），实验组（n=22）。实验组糖尿病造模成功20只，随机分为2组（n=10）:糖尿病组（DM）、厄贝沙坦+糖尿病组（Ir+DM）。8周后测定空腹血糖（FBG）水平，计算各组大鼠体重（BW）、心体比（H/B）和左室重量指数（LVWI）；Masson染色观察心肌形态及纤维化的发生；ELISA检测心肌组织胶原Ⅰ（colⅠ）、胶原Ⅲ（colⅢ）含量；Western blot检测心肌组织ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表达。结果:与CON组相比，DM组大鼠FBG水平、H/B、LVWI显著升高，体重显著减轻，colⅠ、colⅢ含量显著增加，心肌组织p-ERK1/2蛋白表达及p-ERK1/2/ERK1/2比值增加（P＜0.05，P＜0.01），ERK1/2无明显变化。Masson染色显示DM组心肌胶原纤维粗大，交织成网状，排列分布不均，沉积增多。与DM组大鼠相比，厄贝沙坦干预后大鼠体重明显增加，H/B、LVWI、心肌组织colⅠ、colⅢ含量明显降低（P＜0.05，P＜0.01），p-ERK1/2蛋白表达及p-ERK1/ 2/ERK1/2比值降低（P＜0.01），且心肌形态改善明显。结论:糖尿病可诱导心肌纤维化的发生，厄贝沙坦可通过抑制ERK的活化减轻糖尿病诱导的心肌纤维化损伤。

糖尿病；心肌纤维化；厄贝沙坦；ERK通路；大鼠

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.008

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）作为一种慢性进行性内分泌疾病近年来已成为糖尿病（diabetesmellitus，DM）并发症研究领域的热点之一，其病理改变包括细胞凋亡、心肌肥大和心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）的发生等。心肌纤维化是临床上引起糖尿病心肌病的重要因素之一，是诱导心室舒张功能不全的重要原因［1］，也是决定心血管疾病患者预后的主要因素之一［2］。

厄贝沙坦作为血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，临床应用广泛，主要用于治疗高血压以及合并高血压的Ⅱ型糖尿病肾病等。厄贝沙坦可改善肾血管性高血压所致的心肌纤维化［3］。厄贝沙坦是否可逆转糖尿病诱导的心肌纤维化国内外报道较少。

Ras/MEK/ERK通路是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号转导通路中的重要路径之一，参与细胞生长、增殖、分化、凋亡等生理过程。ERK1/2主要被各种生长因子、过氧化氢、离子射线等磷酸化而激活，激活的p-ERK1/2可促进某些基因的转录与表达。Xin［4］等人观察到高糖诱导的糖尿病心肌纤维化可能与激活ERK信号通路有关。Vivian［5］等也观察到在糖尿病心肌纤维化过程中，p-ERK1/2呈增加趋势。厄贝沙坦是否可以通过降低ERK1/2活性而对抗糖尿病心肌纤维化的发生？因此，本实验拟建立糖尿病大鼠模型，观察厄贝沙坦是否可对抗糖尿病心肌纤维化的发生，并进一步分析厄贝沙坦是否通过抑制ERK信号通路而对抗糖尿病诱导的心肌纤维化。

1 材料与方法

1.1 实验动物

链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）购自Sigma公司；厄贝沙坦片（Irbesartan tablets）购自赛诺菲（杭州）制药有限公司分装，批准文号:国药准字J20130049；胆固醇、胆酸盐购自安徽安特食品股份有限公司；colⅠ，colⅢELISA试剂盒购自苏州卡尔文生物科技有限公司；β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司；p-ERK1/2、ERK1/2抗体购自Anbo公司；羊抗小鼠及羊抗兔二抗购自武汉博士德公司；ECL发光试剂盒购自Millipore公司。采用易速得血糖分析仪及配套的台欣试纸测定大鼠空腹血糖变化。

1.2 糖尿病模型复制及分组

健康清洁级雄性SD大鼠（160～180 g）32只，购自苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司。适应性喂养1周后随机分为正常对照组10只和实验组22只，对照组（control，CON）大鼠常规饮食，实验组大鼠给予高糖、高脂、高胆固醇饮食（67%基础饲料+ 20%白砂糖+10%猪油+2.5%胆固醇+0.5%胆酸盐），4周后实验组大鼠禁食12 h，一次性腹腔注射链脲佐菌素30mg/kg（对照组大鼠给予同等剂量柠檬酸钠缓冲液腹腔注射），72 h后静脉取血测定空腹血糖，连续3 d血糖≥16.7 mmol/L且进食、饮水、尿量明显增多即为糖尿病大鼠造模成功［6，7］。每周测血糖，＜16.7mmol/L者剔除。剔除血糖不合格大鼠2只，将模型复制成功的20只大鼠随机分为糖尿病组（DM，n=10）和厄贝沙坦+糖尿病组（Ir+DM，n =10），Ir+DM组给予厄贝沙坦50 mg/（kg·d）灌胃［8］，CON和DM组给予等体积的生理盐水，继续饲养8周。

1.3 空腹血糖检测

糖尿病造模8周后，禁食12 h，清晨称量大鼠体重，测定空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）水平。

1.4 心体比、左室重量指数检测

4%水合氯醛以1 ml/100 g麻醉大鼠，打开心腔，取心脏，剔除多余组织，生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重心脏质量及左室质量，以全心质量与体质量之比作为心脏指数（heart weight/body weight，H/B，mg/g），以左室质量与体质量之比作为左室重量指数（left ventricularweight index，LVWI，mg/g）。

1.5 ELISA检测心肌组织中colⅠ、colⅢ含量水平

适量组织加生理盐水研碎取上清，按照大鼠colⅠ、colⅢELISA检测试剂盒说明书进行余下操作。

1.6 Masson染色

大鼠处死后，取心尖部，4%的多聚甲醛固定，石蜡包埋，Masson染色，镜下观察心肌组织的变化及胶原分布。

1.7 Western blot检测心肌组织ERK1/2、p-ERK1/ 2蛋白表达

取各组标本0.1 g研磨，4℃离心（12 000 r/min，30min），取上清，BCA法测定蛋白浓度，以总蛋白0.08mg上样，样品蛋白变性、配胶、电泳、转PVDF膜，脱脂奶粉封闭2 h，TBST稀释一抗ERK1/2（1∶500）、p-ERK1/2（1∶500），加一抗，4℃过夜，次日TBST洗膜4次，加二抗（1∶10 000），水浴摇床，洗膜。ECL试剂显色，曝光成像。凝胶成像系统测量所得条带的灰度值，计算p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表达的相对量。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠空腹血糖、体重、心体比、左室重量指数水平

与CON组大鼠相比，DM组大鼠的FBG、H/B、LVWI显著升高，BW显著减轻，差异有统计学意义（P＜0.01）；与DM组相比，Ir+DM组的H/B、LVWI明显降低，BW显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），FBG水平无统计学差异（表1）。

Tab.1 Changesof FBG levels，BW，H/B and LVWIin differentgroups（±s，n=10）

Tab.1 Changesof FBG levels，BW，H/B and LVWIin differentgroups（±s，n=10）

CON:Control；DM:Diabetesmellitus；Ir+DM:Irbesartan+diabetesmellitus；FBG:Fasting blood glucose；BW:Bodyweight；H/B:Heartweight/bodyweight；LVWI:Leftventricularweight index**P＜0.01 vs CON；#P＜0.05，##P＜0.01 vs DM

Group　FBG（mmol/L）　BW（g）　H/B（mg/g）　LVWI（mg/g）CON　5.85±1.06　264.17±8.52　2.79±0.15　1.54±0.10 DM　32.17±2.15**　220.83±5.34**　4.30±0.12**　2.20±0.16**Ir+DM　30.28±1.43　242.17±3.31##　3.36±0.10##　1.87±0.17#

2.2 ELISA检测心脏组织中colⅠ及colⅢ的含量

与CON组相比，DM组大鼠心脏组织中colⅠ及colⅢ的含量显著增加（P＜0.01），厄贝沙坦干预后colⅠ及colⅢ含量显著下降（P＜0.01，表2）。

Tab.2 Comparison of colⅠand colⅢcontent inmyocardial tissue among various groups（ng/g，±s，n =10）

Tab.2 Comparison of colⅠand colⅢcontent inmyocardial tissue among various groups（ng/g，±s，n =10）

CON:Control；DM:Diabetesmellitus；Ir+DM:Irbesartan+ diabetesmellitus**P＜0.01 vs CON；##P＜0.01 vs DM

Group　 ColⅠ　ColⅢCON　132.3±8.4　33.6±2.6 DM　286.1±8.4**　79.3±2.6**Ir+DM　177.1±7.2##　46.8±3.0##

2.3 各组大鼠心脏Masson染色

Masson染色后，心肌细胞呈红色，胶原纤维呈蓝绿色。CON组心肌排列整齐且分布均匀，胶原纤维散在分布或呈条索状，DM组胶原纤维粗大，交织成网状或堆积成片状，排列分布不均，沉积增多，厄贝沙坦干预后心肌形态改善明显（图1，见彩图页Ⅲ）。

2.4 心脏组织ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的变化

与CON组相比，DM组大鼠心肌p-ERK1/2蛋白表达及 p-ERK1/2/REK1/2比值显著增加（P＜0.01），ERK1/2蛋白表达变化不明显；与DM组相比，Ir+DM组大鼠心肌p-ERK1/2蛋白表达及p-ERK1/2/REK1/2比值均显著降低（P＜0.01），ERK1/2变化不明显（图2）。

3 讨论

糖尿病心肌病由Rubler等在1972年首次提出［9］，是独立于高血压、冠心病、动脉粥样硬化、心脏瓣膜病等之外的一种特异性心肌病变。心肌纤维化即心脏局部成纤维细胞过度增殖，心肌细胞间质胶原沉积等，是临床上引起糖尿病心肌病的重要因素之一，在糖尿病患者的心衰及猝死中起着重要作用，目前具体机制尚不清楚。因此，探讨心肌纤维化发病机制，研究其可能的治疗措施，对于改善糖尿病患者的预后具有重要意义。

Fig.2 The representiveWestern blot results（±s，n=10）A，B，C:Quantitative analysis of p-ERK1/2 and ERK1/2 protein expressions；D:The ratio of p-ERK1/2/ERK1/2 in myocardial tissues of diabetic rats；CON:Control；DM:Diabetesmellitus；Ir+DM:Irbesartan+diabetesmellitus

本实验建立2型糖尿病模型，在8周时FBG测量值显著高于正常组，提示模型复制且维持成功。糖尿病大鼠心脏心体比、左室重量指数降低，Masson染色观察到胶原纤维粗大，心肌组织colⅠ、colⅢ含量均显著增加，提示糖尿病已经引起心肌纤维化的发生。

研究发现AngⅡ诱导的腹膜纤维化模型中发现，AngⅡ可以上调ERK1/2磷酸化水平，而应用特异性ERK抑制剂（PD98059）后腹膜纤维化程度明显降低。厄贝沙坦作为AngⅡ受体拮抗剂，在受体水平阻断AngⅡ的生物作用［10］。Tang［11］在实验中观察到厄贝沙坦可以减轻糖尿病心肌病的损伤程度。ERK1/2的磷酸化参与了小鼠糖尿病肾病肾纤维化的发病过程［12］。在白藜芦醇及塞利路尔的抗心肌纤维化研究中也发现，两者通过抑制ERK及ERK激酶的活化从而阻断ERK信号通路并最终发挥抑制心肌纤维化的作用［13］。Zhang［14］在ACE2缺陷引起的小鼠心肌纤维化研究中也发现，p-ERK1/2蛋白表达量、colⅠ及colⅢ含量显著升高，厄贝沙坦治疗后表达量及含量都下调，且纤维化程度降低。本实验中DM组大鼠心肌纤维化同时，心肌组织 p-ERK1/2蛋白表达增加，p-ERK1/2/ERK1/2比值上调，提示ERK通路的激活可能参与了糖尿病引起的心肌纤维化。给予厄贝沙坦治疗后，糖尿病大鼠心体比，左室重量指数均提高，病理改变减轻，心肌组织colⅠ、colⅢ含量皆减少，提示糖尿病心肌纤维化的发生减轻。同时观察到心肌p-ERK1/2蛋白表达显著降低，p-ERK1/2/ERK1/2比值下调，提示厄贝沙坦可能通过抑制ERK通路的激活对抗糖尿病心肌纤维化的发生发展过程。

因此，厄贝沙坦可以对抗糖尿病大鼠心肌纤维化损伤，可能是通过抑制ERK信号通路的激活实现的。当然，糖尿病心肌纤维化的发病原因非常复杂，具体机制尚有待进一步明确。

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Themechanism of irbesartan against diabetes induced myocardial fibrosis in ratmodel

ZHANGGuan-jun1，2，ZHANGWei-ping1，WANG Kai-cheng2，YU Ying1，XIEXue-feng3，GAOQin1△
（1.Departmentof Physiology，Bengbu Medical Cllage，Bengbu 233030；2.Intensive Care Unit，Huishan People's Hospital ofWuxi，Wuxi 214187；3.Department of Life Sciences，Bengbu Medical College，Bengbu 233030，China）

【ABSTRACT】Objective:To observe the protective effectof irbesartan onmyocardial fibrosis in diabetic rats，and analyze the role of extracellular signal-regulated kinase（ERK）pathway in this protection.Methods:Thirty twomale SD ratswere randomly divided into two groups: normal control group（CON，n=10），experimentalgroup（n=22）.Twenty diabetic ratswhich hadmodelled successfullywere randomly divided into two groups:diabetic group（DM，n=10），irbesartan+DM group（Ir+DM，n=10）.After 8 weeks，fasting blood glucose （FBG）level，bodyweight（BW），the ratio of heartweight/body weight（H/B）and left ventricularweight index（LVWI）weremeasured. Themyocardialmorphological and fibrotic changeswere observed by Masson staining.Col Iand col III contentswere evaluated using ELISA method，and the protein expressionsof ERK1/2，p-ERK1/2 in heart tissuewere tested byWestern blot.Results:Comparedwith CON group，in diabetic rats，the levelsof FBG，H/B and LVWIwere increasedwhile BW was decreased.The contentsof col Iand col IIIwere increased aswellas the protein expression of p-ERK1/2 and the ratio of p-ERK1/2/ERK1/2（P＜0.05，P＜0.01），which had the statistic differences，while ERK1/2 protein expressionwas not changed.Masson staining showedmyocardial collagenwas increased，arranged in disorder and uneven distribution.However，in Ir+DM group，BW was increased obviously，H/B，LVWI，the contents of col Iand col IIIwere decreased significantly（P＜0.05，P＜0.01），p-ERK1/2 protein expression and the ratio of p-ERK1/2/ERK1/2 were decreased（P＜0.01），which had the statistic differences.Meanwhilemyocardialmorphologywas improved significantly.Conclusion:Diabetes can induce the happening of myocardial fibrosis，and irbesartan can induce the damage ofmyocardial fibrosis through inhibitting the activation of ERK.

diabetes； myocardial fibrosis； irbesartan； ERK pathway； rat

R363.2

A

1000-6834（2016）03-221-04

国家自然科学基金（81000074）；安徽省自然科学基金（1508085MH169）；蚌埠医学院博士启动基金（Bykf13A05）；蚌埠医学院研究生科研创新计划项目（Byycxz1303）；国家大学生创新训练计划项目（201410367009）

2015-01-09

2015-10-15

Tel:0552-3175268；E-mail:bbmcgq@126.com