野葛藤地上部分葛根素的提取及稳定性研究

李　玲,全沁果,沈艳欣,何福林,邵金华,闫旭宇,*

(1.湖南科技学院 化学与生物工程学院,湘南优势植物资源综合利用湖南省重点实验室,湖南永州 425199;2.浙江大学农业与生物技术学院,浙江杭州 310058;3.中国农业科学院农产品加工研究所,农业部农产品加工质量安全风险评估实验室,北京 100193)



野葛藤地上部分葛根素的提取及稳定性研究

李玲1,2,全沁果3,沈艳欣1,何福林1,邵金华1,闫旭宇1,*

(1.湖南科技学院 化学与生物工程学院,湘南优势植物资源综合利用湖南省重点实验室,湖南永州 425199;2.浙江大学农业与生物技术学院,浙江杭州 310058;3.中国农业科学院农产品加工研究所,农业部农产品加工质量安全风险评估实验室,北京 100193)

以野葛藤地上部分为研究对象,采用乙醇回流法提取其葛根素,在单因素实验基础上选取影响得率的主要因素:提取温度、提取时间、料液比,通过响应面设计,对野葛藤中的葛根素提取条件进行优化,并研究氧化还原剂和金属离子对野葛藤中的葛根素稳定性的影响。结果表明,野葛藤中的葛根素最佳提取工艺条件为:提取温度为79 ℃,提取时间为87 min,料液比为1∶14 g/mL;葛根素得率为2.2515%。葛根素的稳定性实验结果表明:氧化剂H2O2不影响葛根素稳定性,而还原剂Na2SO3导致葛根素吸光度值变化;在金属离子中,Na+、K+两种离子不影响葛根素的稳定性,而Cu2+会改变葛根素吸光度值,对葛根素的稳定性有一定影响。因此,葛根素在生产、贮存及使用过程中应注意避免与还原剂和Cu2+离子存在的环境接触。

野葛藤,葛根素,提取优化,稳定性

野葛为豆科葛属多年生落叶草质藤本植物,在我国分布广泛,为湖南省永州市地区的优势植物资源之一,具有良好的食用与药用价值[1-2]。野葛对湘南地区的地形与气候适应力强,葛藤可迅速蔓延,并与当地植物缠绕[3]。这种定殖扩散能力使其迅速建立起了种群优势,对当地的生态平衡造成了较明显的负面作用[4-6]。葛根素是野葛异黄酮类化合物的主要成分,药用价值突出,市场需求量大[7-8],但葛根素产品的来源多局限于野葛地下块根部位[9-10]。近年来,有关野葛藤中有效成分的研究工作已初步展开,但目前仍将其列为破坏性较强的入侵植物,研究多集中于采用人为方法进行防控,而缺乏有效的后续利用[4-6]。因此,对野葛藤进行功能性成分开发可促进其从生态危害物向植物药用资源转型。目前,葛根的药用范围多集中于地下部分,而较为发达的地上藤茎的利用率很低,除部分葛藤作为饲料外,大都将其作为废弃物丢弃,造成了环境污染与资源浪费。研究地上部分野葛藤的葛根素提取工艺,并针对葛根素提取物进行稳定性研究以探究合适的储存环境,对合理开发野葛产业具有重要的意义。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

野葛藤采摘于湖南省永州市零陵区朝阳岩公园,经学校葛根课题组鉴定为野生葛藤。

葛根素标准品(≥98%)上海源叶生物科技有限公司;超纯水;乙醇为分析纯。

电子天平上海玉博生物科技有限公司;紫外可见分光光度计上海舜宇恒平科学仪器有限公司;电热鼓风干燥箱北京科伟永兴仪器有限公司;台式低速离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司;电热恒温水浴锅金坛市亿通电子有限公司;小型粉碎机天津奈斯特仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1样品前处理把葛根藤用超纯水洗净,干燥粉碎后过筛(100目)备用。

1.2.2葛根素吸光度标准曲线的制作称取约2.0 mg干燥恒重的葛根素对照品,并用溶液浓度为95%的乙醇溶解于50 mL容量瓶中,定容至50 mL,并摇匀,分别精确吸取上述溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL标准溶液至10 mL容量瓶中,并用超纯水定容;另以1 mL浓度为95%乙醇加水至10 mL的溶液做空白对照,将配制好的溶液在250 nm下进行比色测定,以对葛根素质量浓度与吸光度作线性回归[11],得葛根素标准曲线回归方程为Y=0.0268X+0.0662,R2=0.9990。

1.2.3野葛藤中葛根素得率的计算

式中:x-葛根素得率(%);A-测量的吸光度;B-稀释的倍数;V-过滤液体的总体积(mL);m-实验原料所称量的质量(g)。

1.3单因素实验

1.3.1提取时间对葛根素得率的影响保持其它浸提条件不变(70%乙醇,在70 ℃水浴下加热,料液比1∶10 g/mL),设置40、60、80、100、120 min 5个水平,平行实验3次,研究浸提时间对野葛藤中葛根素得率的影响。

1.3.2乙醇浓度对葛根素得率的影响在浸提时间2 h、70 ℃水浴温度、料液比1∶10 g/mL下,分别设置10%、30%、50%、70%、90% 5个水平,平行实验3次,考察乙醇浓度对野葛藤中葛根素得率的影响。

1.3.3提取温度对葛根素得率的影响其他工艺条件不变(70%乙醇,浸提时间2 h,料液比1∶10 g/mL),平行实验3次,研究40、50、60、70、80 ℃不同温度下对野葛藤中葛根素得率的影响。

1.3.4料液比对葛根素得率的影响在70%乙醇,浸提时间2 h,水浴温度70 ℃条件下,分别设置浸提料液比1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18 g/mL,平行实验3次,研究不同的料液比对野葛藤中葛根素得率的影响。

1.4响应面实验

在单因素实验的基础上,采用响应面法中的Box-Behnken设计对野葛藤中葛根素的提取工艺进行优化,选取提取时间、提取温度、料液比为考察因素,分别以X1、X2和X3代表,以得率为响应值(Y),实验因素与水平设计如表1所示。

表1　响应面实验因素水平表Table 1　Factors and levels of RAS test

1.5稳定性实验

以吸光度的变化为指标,研究氧化还原剂和金属离子的存在下,野葛藤中葛根素提取物稳定性的变化。分别配制3%、6%、9%、12%、15% H2O2溶液与2.5 mg/mL葛根素1∶1混合,静置3 h,采用紫外分光光度计在250 nm处测定吸光值,检测不同浓度H2O2溶液对葛根素稳定性的影响;分别配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L Na2SO3溶液,与2.5 mg/mL葛根素溶液1∶1混合,静置3 h,采用紫外分光光度计在250 nm处测定吸光度值,检测不同浓度Na2SO3溶液对葛根素稳定性的影响;分别配制0.2 mol/L的Na+、K+、Cu2+溶液,与2.5 mg/mL葛根素溶液以1∶1比例混合,在3 h内,每隔0.5 h采用紫外分光光度计在250 nm处测定吸光值的变化,评价不同金属盐对葛根素稳定性的影响[12]。

1.6数据统计分析

所得数据用Excel 2007作图,并用Design-expert 8.0.5b软件进行分析。

2　结果与分析

2.1单因素实验

2.1.1提取时间对葛根素得率的影响如图1所示,提取时间对野葛藤中葛根素得率有较大影响。80 min以前,随着提取时间的延长,葛根素的得率逐渐提升;在80 min处得率达到最大值,随后逐渐降低,可能是随着提取时间的延长,葛根素的氧化分解速率大于其提取效率,故控制提取时间在80 min左右时,提取效果较好。

图1　提取时间对野葛藤中葛根素得率的影响Fig.1　Effect of extraction time on pueraria extraction rate in the Vine of Pueraria lobata

2.1.2乙醇浓度对葛根素得率的影响如图2所示,乙醇浓度对野葛藤中葛根素得率影响相对其它三个因素表现较弱。低浓度乙醇梯度下,葛根素得率的增长较为缓慢;当乙醇浓度超过50%后,提取效率迅速提高;当浓度为70%时得率最大,继续提高乙醇浓度时,葛根素得率开始降低,表明适当增大乙醇比例会促进这种作用,过高则对反应体系无益,且增加了投料成本。最终确定乙醇的适宜浓度为70%。

图2　乙醇浓度对野葛藤中葛根素得率的影响Fig.2　Effect of ethanol concentration on pueraria extraction rate in the Vine of Pueraria lobata

2.1.3提取温度对葛根素得率的影响如图3所示,可以看出,提取温度对葛根素得率的影响机制较为复杂,在50 ℃和80 ℃处出现了两个极大值点,相对而言,在80 ℃范围内提取结果较为理想。表明在较低温度下,温度的变化与葛根素得率之间存在非线性关系,故应考察温度较高环境下葛根素得率的变化。

图3　提取温度对野葛藤中葛根素得率的影响Fig.3　Effect of extraction temperature on pueraria extraction rate in the Vine of Pueraria lobata

2.1.4料液比对葛根素得率的影响由图4知,随着料液比的提高,葛根素的得率总体呈先升后降趋势。料液比为1∶14 g/mL之前,葛根素得率逐渐升高;继续提高料液比,其得率开始下降。其原因可能是料液比的变化能直接影响葛根素在植物细胞内外的扩散平衡,使得得率上下浮动。

（2）热处理调质后变形风险大 根据技术条件的性能试料要求编制的粗加工图如图2所示，增加性能试料区和粗加工余量后粗加工尺寸变为φ6430mm×350mm。虽然在工艺准备时充分考虑到变形因素并适当增加厚度方向上的余量，力求在源头上保证热处理变形后尺寸能够满足精加工要求，但管板直径大、壁厚小、高径比小，热处理调质时容易变形，调质后变形风险大。

图4　料液比对野葛藤中葛根素得率的影响Fig.4　Effect of the solid-liquid ratio on pueraria extraction rate in the Vine of Pueraria lobata

2.2响应面实验

根据单因素实验结果,并考虑实际情况,确定乙醇最佳提取浓度为70%,在此基础上以提取时间、提取温度、料液比为考察因素,以得率为响应值,设计响应面实验,方案见表1。

表2　野葛藤中葛根素提取响应面实验设计及结果Table 2　Design and experiment results of response surface methodology of pueraria extraction in the Vine of Pueraria lobata

表3　回归模型方差分析Table 3　Analysis of variance for the regression model

注:**p<0.01为极显著;*p<0.05为显著。

采用Design expert 8.0.5b软件对表2中实验结果进行多项拟合回归,得到野葛藤中葛根素得率(Y)对提取时间(X1)、提取温度(X2)、料液比(X3)的二次多项回归模型方程:Y=2.23+0.061X1-0.071X2+0.035X3+0.0025X1X2-0.01X1X3-0.01X2X3-0.088X12-0.33X22-0.14X32。

2.2.1响应面实验模型方差分析为了检验回归方程的有效性,进一步确定各因素对野葛藤中葛根素得率的影响程度,对回归模型进行了方差分析,结果见表3。模型的p<0.0001,极显著;失拟项的p值为0.0558,不显著,决定系数为0.9869,响应值的变化有98.69%来源于所选因素,即来源于提取时间、提取温度、料液比,说明模型拟合度好,回归方程能很好的描述各因素与响应值之间的关系,该实验方法可靠[13]。

回归模型中一次项的p值均小于0.01,达到极显著,二次项的p值亦小于0.0001,说明实验中3个因素的二次项都具有极显著影响;而其交互项及失拟项显著性较差。这表明实验因素对响应值不是简单的线性关系,而是一种非线性关系[14]。单考察p值大小,可确定各因素的效应关系为:X2(提取温度)>X1(提取时间)>X3(料液比)。

响应曲面坡度越陡峭,表明响应值对于操作条件的改变越敏感;反之曲面坡度越平缓,操作条件的改变对响应值的影响也就越小[15]。图5直观地反映了各因素交互作用对响应值的影响,提取时间和提取温度的陡峭程度相对较高,表明其对野葛藤中葛根素得率的交互作用相对明显。

图5　各提取因素之间的交互作用影响Fig.5　Effect of interaction of Extraction factor on the yield of pueraria

2.2.2验证性实验用Design-expert 8.0.5b软件对二次多项式回归方程进行计算,得到最佳的提取条件为提取温度78.93 ℃,提取时间为86.77 min,料液比为14.24倍乙醇体积,预测得率为2.25031%。考虑到单因素实验结果及实际操作的局限性,野葛藤中葛根素的提取工艺最终修正为:提取温度79 ℃、提取时间87 min、料液比1∶14 g/mL。此条件下进行实验验证,设置4次平行实验,如表4所示,得到野葛藤中葛根素最大得率为2.2515%,几乎等同于预测值,表明模型可靠。

2.3稳定性实验

2.3.1氧化剂对葛根素稳定性的影响由图6知,随着H2O2处理浓度的提高,葛根素提取物的吸光度的下降幅度很小,说明氧化剂对野葛藤中葛根素的稳定性影响小。

表4　葛根素得率Table 4　Extraction rate of pueraria

图6　氧化剂对野葛藤中葛根素稳定性的影响Fig.6　Effect of oxidant on the stability of pueraria in the Vine of Pueraria lobata

2.3.2还原剂对葛根素稳定性的影响如图7所示,葛根素溶液中添加还原剂Na2SO3后,吸光度随着还原剂Na2SO3浓度的增大而逐渐增加。这可能是随着还原剂的加入使葛根素最大吸收波长发生偏移,导致吸光度增加[15]。因此,葛根素在生产、贮存及使用过程中应注意避免与还原剂接触。

图7　还原剂对野葛藤中葛根素稳定性的影响Fig.7　Effect of reducing agent on the stability of pueraria in the Vine of Pueraria lobata

2.3.3金属离子对葛根素稳定性的影响由图8可以看出,加入Na+、K+两种金属离子后,葛根素的吸光度值基本不变,而加入Cu2+后,吸光度随着时间的延长而增加,Cu2+或能与葛根素生成某种配合物以致最大吸收波长发生偏移[12],故葛根素应避免与含有Cu2+的溶液接触。

图8　金属离子对野葛藤中葛根素稳定性的影响Fig.8　Effect of mental ion on the stability of pueraria in the Vine of Pueraria lobata

3　结论

在不考虑其他因素的情况下,根据单因素优化及响应面实验数据分析得到野葛藤中葛根素最佳提取条件:提取温度为79 ℃,提取时间为87 min,料液比为1∶14 g/mL;葛根素的得率为2.2515%。由方差分析和各因素交互作用可知,野葛藤中葛根素提取条件因素的影响主次顺序为:提取温度>提取时间>料液比。葛根素的稳定性实验结果表明:氧化剂H2O2不影响葛根素稳定性;还原剂Na2SO3会破坏其稳定性,Na2SO3导致葛根素吸光度值变化。因此,葛根素在生产、贮存及使用过程中应注意避免与还原剂接触。Na+、K+两种离子不影响葛根素的稳定性,而Cu2+离子对葛根素稳定性影响较大,会改变其吸光度值,应尽量避免与其接触。本研究对延长野葛加工的产业链有一定的参考价值,为明确葛根素的适宜环境提供了一定的参考,并且为今后开发野葛藤广泛的保健及药用价值提供了一定的理论依据。

[1]熊力夫,熊劲雅,刘益群.葛根规范化栽培技术研究[J].湖南农业科学,2010(11):31-33.

[2]李汉生.发展葛根生产前景广阔[J].农村新技术,2009,(20):20.

[3]沈夏淦.葛藤-乔灌木的杀手[J].花卉,2006(5):35.

[4]李玲,徐志防,韦霄,等.金钟藤和葛藤在干旱与复水条件下的生理比较[J].广西植物,2008,28(6):806-810.

[5]黄乔乔,沈奕德,范志伟,等.五指山不同林型土壤对金钟藤幼苗生长的影响[J].生态环境学报,2013,22(1):95-99.

[6]Follak S.Potential distribution and environmental threat of Pueraria lobata[J].Central European Journal of Biology,2011,6(3):457-469.

[7]Jia L,Li Z,Li C,et al.Molecular cloning and characterization of an isoflavone 7-O-glucosyltransferase from Pueraria lobata[J].Plant Cell Reports,2014,33(7):1173-1185.

[8]Han E B,Chang B Y,Kim D S,et al.Melanogenesis inhibitory effect of aerial part of Pueraria thunbergianainvitroandinvivo[J].Archives of Dermatological Research,2015,307(1):57-72.

[9]白东义,佟春玲,韩慧,等.葛根素的药理作用及其临床应用研究进展[J].江苏中医药,2009,41(3):76-78.

[10]夏华玲.葛根素的药理作用研究进展[J].时珍国医国药,2006,17(3):434-435.

[11]潘璐琳,欧阳臻,杨雨,等.葛根及复方中葛根素在大鼠体内的药动学研究[J].中国药学杂志,2009,44(9):703-705.

[12]国海东,蒋艳,上官新晨,等.葛根素的稳定性研究[J].食品科技,2014,39(11):229-232.

[13]周婷婷,郑杨,吕茜,等.响应面法优化高溶解性花生蛋白提取工艺[J].食品科学,2012,33(22):22-26.

[14]董万领,闫晓明,程江华,等.响应面法优化水提菜籽多糖工艺[J].中国油脂,2014,39(4):87-89.

[15]刘艳清,汪洪武,蔡璇,等.响应面法优化栀子总黄酮提取工艺研究[J].中药材,2014,37(2):333-337.

Study on the extraction and stability of pueraria in aerial parts of the Vine ofPuerarialobata

LI Ling1,2,QUAN Qin-guo3,SHEN Yan-xin1,HE Fu-lin1,SHAO Jin-hua1,YAN Xu-yu1,*

(1.Department of Chemistry and Biological Engineering,Hunan University of Science and Engineering,Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South,Yongzhou 425199,China;2.College of Agriculture and Biotechnology,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;3.Institute of Agro-products Processing Science and Technology,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Laboratory of Agro-products Quality Safety Risk Assessment,Ministry of Agriculture,Beijing 100193,China)

In this experiment,pueraria was extracted from the Vine ofPuerarialobatausing ethanol refluxing method.The main influence factors(the extraction temperature,the extraction time,the solid-liquid ratio)of extraction rate were selected from the results of single factor test,the extraction conditions of pueraria were optimized by response surface design,and its stability to oxidizer(reducer)and metal ion was studied.The results showed that the optimum extraction technology was for the extraction temperature 79 ℃,the extraction time was 87 min,and the solid-liquid ratio of 1∶14 g/mL,the extraction rate of pueraria was 2.2515%.The stability results indicated that the pueraria were not affected by H2O2as the oxidizing agent,but the change of the absorbency was caused by Na2SO3as the reducing agent.The stability of pueraria was not affected by Na+and K+,but it was influenced by Cu2+.So the storage and use of the pueraria process should avoid contacting with reducing agent and Cu2+.

Vine ofPuerarialobata;pueraria;extraction and optimization;stability

2015-08-07

李玲(1982-)，女，博士，副教授，研究方向：植物生物技术，E-mail：liling7826@126.com。

闫旭宇(1979-)，男，硕士，讲师，研究方向：植物生物技术，E-mail:yanxuyu1979@163.com。

中国博士后科学基金面上项目(2014M561768)；湖南科技学院湘南优势植物资源综合利用湖南省重点实验室开放基金XNZW14C12；湖南省永州市2015年度指导性科技计划项目2015-10号；永州市科技创新项目(永财企指2015[25]号-9)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)09-0235-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.037