豆天蛾多糖CBP3结构初步研究

田　华

(信阳师范学院生命科学学院,河南信阳 464000)



豆天蛾多糖CBP3结构初步研究

田华

(信阳师范学院生命科学学院,河南信阳 464000)

对豆天蛾多糖CBP3的结构进行表征,研究发现豆天蛾多糖CBP3的单糖组成是甘露糖、葡萄糖和半乳糖,其摩尔比是27.89∶1∶3.16,不含核酸和蛋白质等杂质成分。综合IR、1H-NMR、β-消去反应、KI-I2反应,X-衍射、扫描电镜分析,推测豆天蛾多糖CBP3可能为含羧基的酸性多糖,具有较长的侧链和较多的分枝,可能含O-型糖肽键,以β-型吡喃环的形式存在。有少部分多糖以晶体形式存在,大部分为无定形物质。

豆天蛾,多糖,单糖组成,结构

多糖广泛存在于动物、植物、微生物和真菌等,许多多糖具有免疫调节、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒、保护胃肠系统等多种生物学活性[1]。多糖的化学结构异常复杂[2-3],多糖的结构是其生物活性的基础,深入研究多糖的一级和高级结构对阐述多糖类物质的作用机理有重要的理论意义。通常多采用物理方法和化学分析方法相结合来分析多糖的结构[4]。在测定多糖的一级结构时,首先要知道多糖单糖种类及比例,可用凝胶渗透色谱、纸层析、薄层层析、气相色谱、高效液相色谱法、毛细管电泳等方法测定;然后判断单糖残基构型、糖苷键位置、糖环结构、组成单糖残基顺序、糖苷α和β异构体类型等[5]。

目前多糖研究主要以真菌、植物为主,动物多糖研究相对较少,昆虫多糖研究极少。目前国内主要有蚕蛹多糖、蛹虫草多糖、牛虻抗凝血多糖、白蜡虫多糖、喙尾琵琶甲多糖和蟑螂多糖、白僵蚕多糖、蛴螬多糖、美洲大蠊硫酸粘多糖、豆天蛾多糖的提取纯化及功能研究,其它昆虫活性多糖及其功能研究未见报道。豆天蛾属鳞翅目(Lepidoptera)天蛾科(Sphingidae)云纹天蛾亚科(Ambulicinae)豆天蛾属(ClanisHübner),是大豆生产上的暴发性害虫,同时又是一种特佳的高蛋白食物,具有增强人体免疫功能,提高人体的抗病、抗癌能力,有降血脂、降血压和治疗胃寒疾病及营养不良的特殊疗效[6]。田华等[7]对豆天蛾多糖CBP3抗氧化活性进行了研究,结果发现豆天蛾多糖CBP3具有良好的体外抗氧化活性。因此,本论文对前期分离得到的均一多糖豆天蛾CBP3的结构进行初步研究,为深入研究豆天蛾多糖的构效关系提供必要的理论基础。本研究结果可用以指导豆天蛾多糖功能食品的开发,从而可创造良好的经济价值和社会效益,同时还可为豆天蛾多糖的生物学和医药学研究奠定相关的理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

豆天蛾幼虫河南周口市郊区,在昆虫实验室进行养殖备用;PTA409PC热分析仪德国NETZSCH公司;DU800紫外可见分光光度计美国贝克曼库尔特有限公司;TENSOR27傅立叶变换红外光谱仪德国Bruker公司;Bruke DRX-500超导核磁共振谱仪日本电子株式会社;S-4800扫描电子显微镜日本HITACHI公司;Agilent 1200高效液相色谱美国Agilent公司;MILLQBIOCEL超纯水组合系统美国MLLIPORE公司;D8/ADVANCE X-衍射仪德国 Bruker公司。

1.2实验方法

1.2.1豆天蛾多糖CBP3的制备工艺流程豆天蛾5龄幼虫→饥饿2 d→沸水烫死→洗净,55 ℃恒温烘干至恒重→冷却至室温→微型植物粉碎机粉碎→过40目筛→55 ℃恒温烘干至恒重→5倍体积95%乙醇浸泡过夜→过滤,残渣挥干→热水浸提(浸提时间1.5 h,浸提温度90 ℃,料液比1∶20)→4000 r/min离心10 min(滤渣重复1次)→上清液→旋转薄膜蒸发浓缩→95%乙醇沉淀→沉淀物用蒸馏水复溶→95%乙醇醇沉→重复3次→无水乙醇洗涤沉淀→真空冷冻干燥→豆天蛾多糖CBP1(ClanisbilineatatsingtauicaPolysaccharides NO.1)→脱蛋白→脱色→透析→豆天蛾多糖CBP2(ClanisbilineatatsingtauicaPolysaccharides NO.2)→分级→豆天蛾多糖CBP3(ClanisbilineatatsingtauicaPolysaccharides NO.3)→经纯度鉴定为均一多糖。

1.2.2单糖组成测定分析采用HPLC测定豆天蛾多糖CBP3单糖组成。采用Hypersil BDS C18柱,250 mm×4.6 mm,流动相乙酸钠0.02 mol/L,流速1 mL/min,检测波长250 nm,等度洗脱,柱压30Bar,柱温25 ℃,进样量20 μL。测定方法是将不同的单糖溶解于蒸馏水中,分别配制成1%的标准单糖溶液。精密称取豆天蛾多糖CBP3 10 mg 溶解于2.5 mL蒸馏水中,加入2 mol/L浓H2SO42.5 mL,充氮气封口,在烘箱中110 ℃水解8 h,用碳酸钡粉中和水解液至pH7.0,以2000 r/min离心10 min,沉淀用蒸馏水洗涤三次,合并上清液,过滤,浓缩,上高效液相色谱前脱气并用0.45 μm滤膜过滤。多糖的单糖组成及摩尔比由标准单糖的保留时间和峰面积决定[8-9]。

1.2.3紫外光谱(UV)测定制备0.1 mg/mL 豆天蛾多糖CBP3水溶液,在190～390 nm 范围内进行紫外全扫描。

1.2.4红外图谱测定取豆天蛾多糖CBP3适量,与干燥的KBr混合均匀,玛瑙研钵研磨,压片,放入红外光谱仪在波数4000～400 cm-1范围内进行红外光谱扫描。

1.2.5β消去实验称取5 mg豆天蛾多糖CBP3样品2份,分别加入5 mL 0.2 mol/L NaOH水溶液和5 mL蒸馏水,于45 ℃反应3 h后进行190～400 nm紫外扫描。

1.2.6碘-碘化钾反应称取适量豆天蛾多糖CBP3样品,溶于蒸馏水中,配制成1 mg/mL的多糖溶液,取2 mL加入1.2 mL碘试剂(含0.02% I2的0.2%KI溶液),充分混合均匀后置于紫外可见分光光度计进行190～700 nm波长扫描。

1.2.7综合热分析测试采用德国耐驰PTA409PC热分析仪研究豆天蛾多糖CBP3多糖的热特性,加热速度10 ℃/min,0～850 ℃,得到DAT/TG曲线。

1.2.8核磁共振(NMR)将豆天蛾多糖CBP3溶解于D2O中,配制成浓度为30 mg/mL多糖溶液,用Bruke DRX-500型400 MHz超导核磁共振谱仪,观察频率22.5 MHz,温度50 ℃。

1.2.9X-衍射(XRD)德国Bruker D8 Advance X-射线粉末衍射仪,Cu Kα1.5405 Å,电压40 kv,电流30 A,扫描范围2θ为5～90°,扫描步长0.1°,扫描速率4°/min,衍射途中的结晶区和无定形区(非结晶区)采用OriginPro8.0软件分析。

1.2.10扫描电镜观察(SEM)将豆天蛾多糖CBP3样品粘着于样品台上,置真空喷镀仪内镀导电层铂(Pt),厚度10 nm,采用HITACHI S-4800扫描电镜观察,电子加速枪1000 Volt。

2　结果与分析

2.1单糖组成

将鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖分别进行HPLC分析,各标准单糖的保留时间见图1。完全酸水解的豆天蛾多糖CBP3进行高效液相色谱分析,结果如图2所示,将各个峰保留时间及各相应峰面积与标准单糖对照可知单糖的组成和比例,豆天蛾多糖CBP3的单糖组成是甘露糖、葡萄糖和半乳糖,其摩尔比是27.89∶1∶3.16。

图1　标准单糖HPLC 色谱图Fig.1　The HPLC chromatogram of the standard monosaccharide

图2　豆天蛾多糖CBP3的HPLC色谱图Fig.2　The HPLC chromatogram of CBP3

2.2紫外图谱测定(UV)

豆天蛾多糖CBP3水溶液紫外吸收光谱图见图3,紫外吸收光谱显示260 nm和280 nm处无明显吸收峰,表明其不含核酸和蛋白质等杂质成分。190～210 nm之间有多糖的吸收峰[10]。

图3　豆天蛾多糖CBP3溶液紫外扫描光谱Fig.3　UV spectrum of CBP3

2.3红外图谱(IR)测定

红外光谱图上的每一个吸收峰,都相应于分子中原子或官能团振动的情况,利用红外光谱可以检验分子中的一些官能团和氢键的存在,对未知化合物的结构分析提供信息[11]。一张红外吸收光谱图可分为特征吸收区(4000～1333 cm-1)和指纹区(1333～500 cm-1),一些有机结构的官能团在特征区可显示一些特征吸收[8]。采用KBr固体压片法,在4000～400 cm-1区间内对豆天蛾多糖CBP3进行红外光谱扫描,结果见图4,图4表现出一般多糖类物质的特征吸收峰:3429 cm-1处为分子间O-H键的伸缩振动;2933 cm-1处为饱和氢CH3、CH2、CH等C-H键的伸缩振动;1652 cm-1处的吸收峰为C=O伸缩振动峰、C=O的非对称伸缩振动峰,多糖中可能含有COOH;1340、1434 cm-1为分子中C-O键的对称伸缩振动和C-H的变角振动,885 cm-1为β葡萄糖吡喃环C-H键的变角振动,767 cm-1吡喃环对称环伸缩振动。在N-H变角振动区1650～1550 cm-1附近有1652 cm-1吸收峰,可能为蛋白质吸收峰,与β-消去反应推测豆天蛾多糖CBP3可能含有O-型糖肽键结论一致。因此,豆天蛾多糖CBP3的单糖残基可能以β型吡喃环的形式存在。

图4　豆天蛾多糖CBP3红外光谱图(IR)Fig.4　IR spectrum of CBP3

2.4β消去反应

在稀碱溶液的作用下,O-型糖肽键能发生β-消去反应,与糖链连接的丝氨酸转化成α-氨基丙烯酸,苏氨酸转化为α-氨基丁烯酸,形成的不饱和氨基酸在240 nm处有明显的紫外吸收,而与天冬酰胺相连的N-型糖苷键则不会发生此变化[11]。因此,利用β-消去反应来检测糖蛋白糖肽键简单快速。豆天蛾多糖CBP3经0.2 mol/L NaOH处理前后紫外图谱见图5,由图5可知,经0.2 mol/L NaOH处理后豆天蛾多糖CBP3在240 nm附近紫外吸光值明显增加,表明豆天蛾多糖CBP3可能含有O-型糖肽键。

图5　0.2 mol/L NaOH处理前后 豆天蛾多糖CBP3的紫外图谱Fig.5　UV spectrum of CBP3 treated by 0.2 mol/L NaOH

2.5碘-碘化钾反应

豆天蛾多糖CBP3水溶液与碘试剂混匀后紫外图谱如图6所示,由于豆天蛾多糖CBP3与KI-I2的反应物最大吸收峰在224 nm处,而在565 nm处无最大吸收,说明豆天蛾多糖CBP3具有较长的侧链和较多的分枝[12]。

图6　豆天蛾多糖CBP3水溶液碘-碘化钾反应紫外图谱Fig.6　KI-I2 UV spectrum of CBP3

2.6综合热分析

图7是豆天蛾多糖CBP3热特性分析DTA/TG曲线,由图7可以看出,加热过程中有2次大的物质损失过程,这与多糖的组成、所含水分质量分数以及凝聚形态有关。由TG曲线可以看出,豆天蛾多糖CBP3在27～144.04 ℃之间有一个失重峰,其失重率为25.39%;在144.04～540.75 ℃之间有一个很大的失重峰,其失重率为47.14%;在540.75～810.54 ℃之间有一个很小的失重峰，其失重率为1.69%。由DTA曲线可以看出,在115.77 ℃有一个吸热峰,可能为多糖所含水分的蒸发引起的;在341.1、508.40、677.12 ℃处有三个放热峰,其中最大的放热峰为508.40 ℃,可能是豆天蛾多糖CBP3发生了氧化反应所致。

图7　豆天蛾多糖CBP3热特性分析Fig.7　Thermal analysis of CBP3

2.7核磁共振

图8是豆天蛾多糖CBP3的1H-NMR图谱,图中C-1 质子的化学位移小于5 ppm,这表示CBP3的组成单糖中,主要以β-型异构体环形结构存在[13-14]。

图8　豆天蛾多糖CBP3的1H-NMR图谱Fig.8　1H-NMR spectrum of CBP3

2.8X-衍射

图9是豆天蛾多糖CBP3 X-衍射图谱,由图9可以看出,豆天蛾多糖CBP3在14.9°、16.1°、21.3°、31.6°、34°、44.5°处有很小的弥散峰外,几乎为无定形物区。说明豆天蛾多糖CBP3结晶性很差,几乎为无定形物质。

图9　豆天蛾多糖CBP3 X-衍射图谱Fig.9　X-Ray diffraction spectrum of CBP3

2.9扫描电镜观察

扫描电镜是研究多糖形貌的一种有效手段,豆天蛾多糖CBP3不同放大倍数的SEM照片如图10所示,豆天蛾多糖CBP3分子以菊花状纤维束紧密的排列成片状,可能有少部分多糖以晶体形式存在,大部分为无定形物质,还有待于进一步研究。

图10　豆天蛾多糖CBP3 SEM照片Fig.10　SEM image of CBP3

3　讨论

3.1豆天蛾多糖CBP3单糖组成

研究发现豆天蛾多糖CBP3由3种单糖组成,其中甘露糖和半乳糖所占的比例较大,特别是甘露糖含量特别高,其摩尔比基本是葡萄糖的28倍,半乳糖的9倍。多糖的分子链以五元呋喃环或六元吡喃环链接而成。不同连接方式的糖苷键形成的多糖溶液具有不同的构象。关于豆天蛾多糖CBP3各单糖的结构及连接方式,红外光谱推测CBP3各单糖以β型吡喃环形式存在,1H-NMR推测各单糖以β-型异构体环形结构存在,碘-碘化钾反应推测豆天蛾多糖CBP3具有较长的侧链和较多的分枝,不存在三股螺旋结构,但豆天蛾多糖CBP3主链和支链是何种组成和连接方式有待进一步研究。

3.2豆天蛾多糖CBP3多糖与蛋白的连接方式

3500～3200 cm-1的两个宽峰时O-H和N-H的伸缩振动,存在着分子间和分子内的氢键。3200～2800 cm-1的一组峰是糖类C-H伸缩振动,1400～1200 cm-1是C-H的变角振动,如果没有这两组峰,则可初步判断该化合物不是糖类化合物[15]。α-型常出现(844±8)cm-1峰,而β-型出现(891±7)cm-1峰。豆天蛾多糖CBP3水溶液紫外吸收光谱结果显示280 nm处无明显吸收峰,红外光谱显示N-H变角振动区1650～1550 cm-1附近有1652 cm-1吸收峰,β-消去反应表明经0.2 mol/L NaOH处理后豆天蛾多糖CBP3在240 nm附近紫外吸光值明显增加,说明豆天蛾多糖CBP3可能含有O-型糖肽键,推测豆天蛾多糖CBP3与蛋白质是以结合蛋白的形式存在,并且豆天蛾多糖CBP3组成上以多糖为主,蛋白的含量较少,还需要进一步的实验验证。

4　结论

本论文对豆天蛾多糖CBP3的结构进行表征。豆天蛾多糖CBP3的单糖组成是甘露糖、葡萄糖和半乳糖,其摩尔比是27.89∶1∶3.16,不含核酸和蛋白质等杂质成分。综合IR、1H-NMR、β-消去反应、KI-I2反应,X-衍射、扫描电镜分析,推测豆天蛾多糖CBP3可能为含羧基的酸性多糖,具有较长的侧链和较多的分枝,可能含O-型糖肽键,以β-型吡喃环的形式存在,有少部分多糖以晶体形式存在,大部分为无定形物质。

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Structure characterizations of polysaccharide CBP3 fromClanisbilineatatsingtauicaMell

TIAN Hua

(College of Life Sciences,Xinyang Normal University,Xinyang 464000,China)

The structure characterizations ofClanisbilineatatsingtauicaMell polysaccharide were investigated.The studies showed that CBP3 was composed of seminose,glucose and galactose in a molar ratio of 27.89∶1∶3.16.The results showed that CBP3 may be a kind acidic polysaccharide containing carboxyl with -o-glycosidic linkages andβ-glucopyranose between sugers and amino acids by means of several analysis methods,such as infrared scanning,H-NMR,β-elimination reaction,KI-I2reaction,x-ray powder diffraction and scanning electron microscopy analysis,which had long side chains and more branches.CBP3 were amorphous materials with crystals partly.

ClanisbilineatatsingtauicaMell;polysaccharide;monosaccharide composition;structure

2015-10-14

田华(1979-)，女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：生物技术,E-mail：xynu0818@163.com。

信阳师范学院青年骨干教师资助计划项目。

TS201.1

A

1002-0306(2016)09-0097-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.011