冠脉结扎法在大鼠急性心肌梗死模型制作中的应用

余惠珍 高洁 郑熙 朱鹏立

冠脉结扎法在大鼠急性心肌梗死模型制作中的应用

余惠珍 高洁 郑熙 朱鹏立

目的 探讨冠脉结扎法制作大鼠急性心肌梗死模型。方法 40只Sprauge-Dawley大鼠随机分为冠脉结扎组和假手术组。大鼠经麻醉后，气管插管连接小动物呼吸机，打开左侧胸腔，暴露心脏，结扎组结扎左冠状动脉前降支，假手术组只用线穿过左前降支而不结扎。手术前后均行心电图检查，4周后行血流动力学检测，取出心脏，观察其外形变化，行HE染色后于显微镜下观察其病理变化。结果 冠脉结扎组制作心梗模型成功率为100%，术后存活率为65%；假手术组术后存活率为80%。冠脉结扎组术后4周取出的心脏，左心室较假手术组扩大，缺血区室壁变薄。结论 冠脉结扎法制作大鼠心肌梗死模型，效果稳定，成功率高，制作方便，经济易推广。

急性心肌梗死；动物模型；大鼠

心肌梗死是一种严重危害人类健康的心血管疾病。国内外众多学者均曾借助家兔、大鼠等动物模型对人类心肌梗死进行研究，目前构建急性心肌梗死模型的方法有冠脉结扎法、药物法和冠脉冷凝法等[1]，但冠脉结扎法是最常用的方法。本研究通过探讨冠脉结扎法在大鼠急性心肌梗死动物模型制作中的运用，为今后心梗后心肌重塑和基因治疗的实验研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康雄性Sprauge-Dawley（SD）大鼠 40 只，体质量（250±20）g，由福建医科大学动物实验中心提供。

1.1.2 实验试剂及仪器 10%水合氯醛（青岛宇龙海藻有限公司）、注射用青霉素钠（80万单位/支，华北制药股份有限公司）、动物呼吸机（江西省特力麻醉呼吸设备有限公司，TKR-200C型）、生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司，BL-420S型）及手术器械等。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 40只SD大鼠随机分为冠脉结扎组（20只）和假手术组（20只）。

1.2.2 呼吸机参数设置 呼吸频率60次/min，吸呼比1∶1.5，潮气量约为3 ml/100 g，吸入氧气浓度为100%。

1.2.3 动物麻醉 大鼠禁食禁水8 h称重，10%水合氯醛按300 mg/kg腹腔注射，注射前注射器回抽检查是否有血回流，以防注入肠道。

1.2.4 心电图检测 麻醉满意后，大鼠以仰卧位固定于手术操作板上，四肢皮下插入针电极（右前肢-负极，右后肢-接地线，左后肢-正极），记录标准Ⅱ导联心电图。

1.2.5 气管插管 颈部皮肤脱毛，碘伏消毒颈部手术野皮肤，取正中切口约2 cm，剪开皮肤，由浅入深钝性分离下颌下腺、颈前肌肉，暴露气管，于甲状软骨下3～4个气管环用带针芯的16G静脉留置针平行插入气管，后拔出针芯，进针深度约2 cm，插管成功后，针套连接已设好参数的呼吸机，见胸廓起伏平稳后用胶带固定。

1.2.6 手术操作 冠脉结扎组：高压蒸汽灭菌法消毒手术器械。左胸前皮肤常规脱毛，铺无菌手术巾，碘伏消毒手术区，以左胸前搏动最明显处为中心，距胸骨中线约1 cm处纵向切开皮肤，长约3 cm，注意避开皮下血管，逐层钝性分离皮下筋膜、肌肉，暴露肋骨，3～4肋间用血管钳钝性分离肋间肌，注意避开肋间血管，在分离的3～4肋间隙置入动物胸廓撑开器，注意避免损伤肺，固定好撑开器后，可见心脏暴露于手术视野，用眼科弯镊轻轻扯开心包，暴露出左心耳、肺动脉圆锥，轻压右侧胸廓，挤出心脏，以左心耳和肺动脉圆锥的交界与心尖连线为缝扎中线，用5-0线缝针从左心耳右缘下方2 mm进针，进针深度为 1.5～2.0 mm，宽度 2～3 mm，结扎时力度适中，防止扯断心肌。结扎后可见从结扎点起至心尖间的大面积心肌变白[1,2]，观察结扎后心电图较结扎前有无变化，若出现心律失常，于心脏表面滴1～2滴利多卡因，待转复后将心脏轻轻回纳胸腔，充分止血后，撤除胸廓撑开器，检查肺是否损伤，置一橡胶软管于胸腔中，一端连接注射器，用4-0缝合线逐层关胸后抽吸注射器，使胸腔形成负压，再拔除橡胶软管，待大鼠苏醒后拔除气管插管，以5-0缝合线逐层缝合颈前肌肉、皮肤。术后予10万单位青霉素钠溶液腹腔注射。假手术组只穿5-0缝合线过左前降支而不结扎，其余步骤均同冠脉结扎组。

1.2.7 术后处理 术后大鼠单笼饲养24 h，保持环境温暖干燥，饲料饮水充足，术后3 d均予腹腔注射青霉素钠溶液10万单位。

1.2.8 血流动力学检测 4周后，以10%水合氯醛麻醉大鼠，分离出右颈总动脉，避免误伤迷走神经，用5-0缝合线结扎已分离动脉远心端，近心端置5-0缝合线备用，眼科剪斜剪该段动脉一V型小口，缓慢置入已被肝素浸润的PE50压力传导管，扎紧近心端缝线，连接BL-420s生物机能实验系统，导管不断向前推进，直至进入左心室，待波形稳定，采集左室舒张末压、心率、左室收缩压、左心室内压最大上升速率（+dp/dtmax）和左心室内压最大下降速率（-dp/dtmax）等。

1.2.9 心肌梗死模型鉴定 血流动力学检测完毕，腹腔注射过量水合氯醛处死大鼠，按“V”字法打开胸腔，取出心脏，洗净积血后观察其外形、大小。

1.2.10 HE染色 将取出的心脏去除心房、右心室，左室用甲醛固定24 h后进行石蜡包埋制成蜡块，3μm/片制成切片备用，按切片脱蜡至水→染色→脱水、透明→封固等步骤进行HE染色。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0分析软件进行统计分析。数值变量以±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠存活情况 冠脉结扎组大鼠共死亡7只，存活率为65%，其中有2只在术后1 h内死亡，1只在术后24 h内死亡，术后观察4周，死亡4只。死亡原因：早期2只疑因术中失血过多、心律失常、麻醉过量所致，1只因腹胀，2只因肺部感染，2只疑因心力衰竭所致。假手术组大鼠共死亡4只，存活率为80%。死亡原因：1只因术中失血过多死亡，1只疑因麻醉过量死亡，2只因肺部感染死亡。

2.2 心脏外形变化 冠脉结扎组在术中结扎后，肉眼可见自结扎点起至心尖间的心肌颜色立即变浅（图1），假手术组则无明显变化。术后4周取出心脏，冠脉结扎组大鼠心脏较假手术组变大，左心室扩大，外形不规则，梗死区心室壁变薄，颜色较浅。

2.3 心电图改变 因大鼠心电图上无明显ST段，冠脉结扎组左前降支结扎后，心电图上可见R波和T波融合成帐篷波。假手术组进针前后无明显变化（图 2）。

2.4 血流动力学变化 冠脉结扎组与假手术组相比，左室舒张末压升高（P＜0.05），等容收缩期+dp/dtmax降低（P＜0.05），等容舒张期-dp/dtmax降低（P＜0.05），表明冠脉结扎组大鼠左心室舒张与收缩功能较假手术组降低，见图3。

2.5 组织病理学 心肌组织切片HE染色镜下观察，假手术组镜下心肌细胞排列整齐，左心室壁厚薄一致，未见明显梗死区，无明显炎症细胞浸润；冠脉左前降支结扎组中，镜下左室壁心肌厚薄不均匀，梗死区明显变薄，成纤维细胞增多，心腔较假手术组扩大，心肌梗死区与非梗死区交界处心肌细胞排列紊乱。见图4。

3 讨论

对于人类心肌梗死疾病临床前期的探讨，现多采用心肌梗死动物模型来研究，国际上制备心梗动物模型的方法有冠脉结扎法、药物法、冠脉冷凝法、介入法等[1]，还有采用基因敲除的方法来造成动物心肌梗死[3]，但应用最多的还是冠脉结扎法。结扎左冠状动脉前降支制作心梗模型在20世纪50年代已基本成熟[4]。较其他方法，冠脉结扎法制作心梗模型操作简单、制作方便、容易推广。大鼠、家兔、猪、牛、羊等动物曾均有报道被用来制作心肌梗死模型[1]。与其他动物相比，大鼠体积小，饲养方便，可单人操作，且有研究发现大鼠心脏动脉走行分布与人类心脏相似[5]，故本实验采用SD大鼠作为研究对象。

我们采用冠脉结扎法制作急性心梗动物模型。冠脉结扎组术中均肉眼可见穿线处以下心肌颜色变浅，结扎后心电图上可见R波和T波融合形成的帐篷波出现，提示急性心梗模型制作成功。冠脉结扎的进针位置是影响急性心肌梗死动物模型是否成功的关键因素，且直接影响术后大鼠的存活率。近年来，有学者研究高位冠脉结扎及低位冠脉结扎对急性心梗动物术后存活率的影响，均认为低位结扎组（约左心耳尖端下0.6～2 mm）存活率明显较高位结扎（主动脉根部下3 mm或紧邻左心耳边缘处）存活率高[1,6]。王勇等[6]的研究结果表明，高位结扎组与低位结扎组术后4周存活率分别为13.3%与66.7%。我们在左心耳下方2 mm处结扎左前降支，术后4周存活率为65%，与低位结扎组数据较为接近。

为保证术后大鼠的存活率，开胸时应尽量避免损伤肺，且呼吸机参数设置恰当较为关键，术毕大鼠尚未完全清醒不宜过早撤离呼吸机，术后大鼠的呼吸道管理是影响大鼠存活率的重要因素，术后将大鼠置于温暖干燥环境中12 h，连续3 d腹腔注射青霉素钠溶液，可防止肺炎的发生，还可将大鼠舌头轻轻拉出以防舌后坠阻塞呼吸道。此外，麻醉药物的选择也是影响大鼠术后存活率高低的关键因素，水合氯醛对术中大鼠的体温、呼吸、心率等影响较小，故本实验选择水合氯醛作为麻醉药物。

近年来，Gao等[7,8]成功利用冠脉结扎法制作小鼠心梗模型而不借助呼吸机等通气设备，较借助呼吸机及大范围开胸制作急性心梗动物模型的传统方法来说术后存活率更高，且减少了术中心律失常的发生，术后小鼠恢复也较传统手术组快。随着该方法的逐渐成熟、模型稳定性的进一步提高，将来可以作为制作心肌梗死动物模型的新选择。

本实验采用冠脉结扎法制作大鼠急性心肌梗死模型成功率高、模型稳定、操作简单、术后易存活、经济易推广，为今后关于心梗后心脏重塑方面的探讨提供了可靠的模型。

图1 左前降支结扎前后心肌变化

图2 两组左前降支结扎前后心电图变化

图3 两组大鼠血流动力学参数测定结果比较

图4 两组心肌组织学特点（HE染色，×100倍）

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The model of acute myocardial infarction in rats by ligation of coronary artery

YU Hui-zhen＊，GAO Jie，ZHENG Xi，et al.＊Geriatric Medicine Research Institution of Fujian Provincial Hospital，Internal medicine，South hospital of Fujian Provincial Hospital，Fuzhou 350001，China

ZHU Peng-li，E-mail：zpl7755@126.com

Objective To investigate the acute myocardial infarction model in rats by ligation of coronary artery.Methods 40 Sprauge-Dawley rats were randomly divided into sham operation group or coronary ligation group.After anesthesia，the rats were tracheal intubated with small animal ventilator，then opened the left chest with left anterior descending coronary artery was ligated.Sham operation group just wear line not ligation.All the rats underwent ECG examination before and after operation.After 4 weeks，the Hemodynamic parameters was detected and the heart was taken out to observe the shape changes，and the pathological changes were observed after HE staining.Results The success rate of acute myocardial infarction model was 100%，the operation group survival rate was 65%，and the sham operation group survival rate was 80%after operation.After 4 weeks of operation，the left ventricle was enlarged and the ventricular wall was thinned in the ischemic region.Conclusion The coronary artery ligation method can make rat myocardial infarction model.Its effect is stable with high success rate，and the production is convenient，economical.

Acute myocardial infarction；Animal model；Rats

福建省自然科学基金面上项目（项目编号：2011J01134）；福建省卫生厅青年骨干培养人才项目（项目编号：2013-ZQN-ZD-2）

350001 福建省福州市，福建省立医院老年医学研究室，福建省临床老年病研究所（余惠珍、高洁、郑熙、朱鹏立）福建省立医院南院内科（余惠珍）；福建医科大学省立临床医学院（高洁、郑熙）

朱鹏立，E-mail：zpl7755@126.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2016.08.020

Q95-33；R542.2+2

A

1672-5301（2016）08-0752-03

2016-02-29）