熊果酸在大鼠自体静脉移植再狭窄模型中抑制血管炎症因子的实验研究

刘盛华 刘小利 李彬 邹增晓

熊果酸在大鼠自体静脉移植再狭窄模型中抑制血管炎症因子的实验研究

刘盛华 刘小利 李彬 邹增晓

目的 探讨熊果酸对大鼠自体静脉再狭窄过程中炎症反应的抑制作用及可能的机制。方法SD大鼠45只，体重300～350 g，随机分成A组、B组和C组，每组15只。A组大鼠不做任何处理；B组和C组大鼠用“套管法”将其右侧颈外静脉移植至右侧颈总动脉；C组术后每天予以熊果酸30 mg·kg-1·d-1灌胃。术后48 h切除右侧颈外静脉检测MCP-1、IL-1α、IL-6和 TNF-α等细胞因子。结果 MCP-1：A组（655.5±47.4）pg/mg，B 组 （7959.7±823.5）pg/mg，C 组 （4339.0±578.8）pg/mg；IL-1α：A 组 （496.8±46.2）pg/mg，B 组（4015.6±427.1）pg/mg，C 组（2838.5±298.9）pg/mg；IL-6：A 组（664.4±63.5）pg/mg，B 组（2414.8±155.1）pg/mg，C组（1325.8±56.4）pg/mg；TNF-α：A 组（149.5±7.8）pg/mg，B 组（546.0±72.6）pg/mg，C 组（286.2±18.6）pg/mg。B 组和C组细胞因子均较A组显著增高，且差异具有统计学意义。C组细胞因子较B组显著降低，且差异具有统计学意义。结论 熊果酸可能通过抑制炎症反应中心物质NF-κB的活化，进而抑制MCP-1、IL-1α，IL-6及TNF-α的表达。熊果酸可以抑制术后静脉桥血管的再狭窄。

冠状动脉旁路移植术；再狭窄；熊果酸

冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass graft，CABG）是治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的最主要外科方法之一。乳内动脉和大隐静脉是最常采用的桥血管。随访资料显示，冠状动脉旁路移植术中乳内动脉吻合前降支，1年通畅率达95.7%，10年通畅率在90.0%以上[1]。研究表明，大隐静脉1年、5年的通畅率分别为93%、74%，10年通畅率仅为50%～60%[2]，远期效果明显不如乳内动脉。目前认为再狭窄可能与大隐静脉在游离过程中的损伤、冠状动脉旁路移植术后血流动力学的改变及炎症因子释放等一系列原因有关。熊果酸（ursolic acid，UA）为脂溶性物质，可以穿透细胞膜起效。多年来国内外学者已研究证明熊果酸具有广泛的生物学活性，包括抗细胞突变、抗氧化、抗炎作用[3]。本研究通过建立大鼠静脉桥再狭窄的动物模型，并予以熊果酸干预，同时设立对照组和模型组，比较术后48 h静脉桥单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein，MCP-1）、白细胞介素-1α（interleukin-1α，IL-1α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等细胞因子。研究熊果酸抑制血管再狭窄的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SPF级大鼠45只，雌雄不拘，体重300～350 g，购自南方医科大学实验动物中心。熊果酸、MCP-1、IL-1α、IL-6、TNF-α ELISA 试剂盒购自上海逸术生物科技有限公司。

1.2 动物分组 将 45只大鼠随机分成 A、B、C组，每组各15只。A组为对照组，不做任何处理。B组为模型组，将大鼠右侧颈外静脉移植至右侧颈总动脉后不予药物干预。C组为熊果酸组，将大鼠右侧颈外静脉移植至右侧颈总动脉，术后当天开始予以 30 mg·kg-1·d-1熊果酸灌胃。

1.3 模型建立 B组和C组大鼠用“套管法”将右侧颈外静脉移植至右侧颈总动脉建立大鼠自体静脉再狭窄动物模型。术后所有大鼠均在SPF级动物实验室饲养。三组大鼠术后第1天开始每只肌注青霉素钠4万U/d，用至术后5 d，每只给予阿司匹林10 mg·kg-1·d-1灌胃抗凝。C组术后当天开始予以大鼠30 mg·kg-1·d-1熊果酸灌胃，直至大鼠取出标本处死。

1.4 标本采集 B、C组分别在术后48 h处死15只大鼠切取移植静脉，A组取右侧颈外静脉，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞因子MCP-1、IL-1α、IL-6及 TNF-α。将测得的样品中细胞因子的蛋白含量转化为pg/mg血管组织。

1.5 统计学方法 采用SAS 8.0统计软件分析数据。计量资料数据采用±s表示，两两比较采用t检验，组间比较采用单因素方差分析。取α=0.05为检验水准。

2 结果

B、C组分别在术后48 h处死15只大鼠切取移植静脉，A组取右侧颈外静脉，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测细胞因子MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α。各细胞因子比较见表1。B组和C组细胞因子均较A组显著增高，且差异具有统计学意义。在术后应用熊果酸组治疗的C组较未予熊果酸干预的B组显著降低，且差异具有统计学意义。

表1 术后48 h静脉桥细胞因子水平比较（±s，pg/mg）

表1 术后48 h静脉桥细胞因子水平比较（±s，pg/mg）

注：MCP-1：静脉桥单核细胞趋化蛋白-1；IL-1α：白细胞介素-1α；IL-6：白细胞介素-6；TNF-α：肿瘤坏死因子-α。与 A 组相比，aP＜0.05；与 B组相比，bP＜0.05

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3 讨论

冠状动脉旁路移植术（CABG）是治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的最主要外科方法之一。乳内动脉和大隐静脉是最常采用的桥血管。随访资料显示，冠状动脉旁路移植术中乳内动脉吻合前降支，1年通畅率达95.7%，10年通畅率在90.0%以上[1]，明显优于大隐静脉。研究表明，大隐静脉1年内可能发生静脉吻合口血栓形成、近端狭窄等并发症，1年、5年的通畅率分别为93%、74%，10年通畅率仅为50%～60%[2]，远期效果明显不如乳内动脉。静脉桥的再狭窄大大降低了手术的远期效果[4]，经过多年的研究对于再狭窄的发生机制仍有许多不明之处。目前认为再狭窄可能与大隐静脉在游离过程中的损伤、冠状动脉旁路移植术后血流动力学的改变及炎症因子释放等一系列变化，术后新生内膜细胞增生、血管平滑肌增殖与迁移所导致血管重塑所共同作用的结果[5]。

熊果酸又名乌索酸、乌苏酸，是广泛存在于自然界中的α-香树脂醇型五环三萜类化合物，通常以游离形式存在，或与糖结合成苷的形式存在，广泛分布于自然界约7个科46个属62种植物中[6]。熊果酸为脂溶性物质，可以穿透细胞膜起效，多年来国内外学者已研究证明熊果酸具有广泛的生物学活性，包括抗细胞突变、抗氧化、抗炎等作用[3]。一直以来熊果酸抗肿瘤机制都是研究的热点。研究表明，熊果酸对NF-κB活化的抑制作用与NF-κB依赖性周期蛋白D1、环氧合酶和基质金属蛋白酶9表达受抑制有关。这些作用可能是熊果酸抗肿瘤和化疗增敏作用的机制[7]。同时，熊果酸对心血管系统的保护作用也已被广泛证实[8]。跟心血管相关的生物学活性包括舒张血管[9]、上调一氧化氮合酶[10]及抑制脂质过氧化[11]等。NF-κB参与调控细胞的众多生理及病理过程，是介导炎症及病理免疫反应过程的中心物质。NF-κB几乎存在于所有的细胞中，在细胞凋亡的过程中是最重要的转录调节因子之一。在免疫反应过程中各种免疫相关受体、炎症因子（MIP-1α、MCP1）、细胞因子（如 IL-1、IL-2、IL-6、IL-12 和 TNF-α、LTα、LTβ、GM-CSF）、黏附分子（ICAM、VCAM、E-selectin）及急性期蛋白（如SSA）等均为其靶基因。NF-κB的激活介导了炎症反应的整个过程。NF-κB可以在炎症反应过程中促进各种炎症因子和细胞因子的基因转录，与此同时，这些炎症因子和细胞因子又可反过来激活NF-κB，这种正反馈的效应进一步放大了炎症反应，对血管平滑肌细胞增生、诱导细胞凋亡的影响而在再狭窄的过程中起着重要的作用。抑制NF-κB介导的炎症反应可为静脉桥再狭窄防治提供新的治疗靶点。

本研究中术后48 h对三组静脉MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α的ELISA检测显示，将颈外静脉移植至颈总动脉后，局部组织MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α明显增加。使用熊果酸的C组较未用熊果酸的B组MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α明显降低。实验表明，颈外静脉移植至颈总动脉后局部会产生炎症反应，熊果酸能抑制静脉桥血管的炎症反应，这也是熊果酸防治静脉再狭窄的药物机制之一。

总之，熊果酸可能通过抑制炎症反应的中心物质 NF-κB 的活化，进而抑制 MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α的表达。熊果酸可以抑制术后静脉桥血管的再狭窄。

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Study the effects of Ursolic acid on inhibition of inflammation in the autologous vein graft restenosis rat model

LIU Sheng-hua＊，LIU Xiao-li，LI Bin，et al.＊Department of Cardiac Surgery，Guangdong Provincial Corps Hospital of Chinese People′s Armed Police Forces，Guangzhou 510000，China

Objective To study the effects of Ursolic acid on inhibition of inflammation and the mechanism in the autologous vein graft restenosis rat model.Methods 45 rats，300-350 kg were randomly divided into 3 groups:group A，B，C.The right external jugular veins were implanted into the right carotid with cuff technique for rats of group B and group C.Ursolic acid 30 mg/kg was administrated daily in rats of group C via gavage.Samples of veins tissues were harvested at 48 hours.MCP-1，IL-1α，IL-6 and TNF-α were test by ELISA.Results MCP-1［Group A（655.5±47.4）pg/mg，Group B（7959.7±823.5）pg/mg，Group C（4339.0±578.8）pg/mg］，IL-1α［Group A（496.8±46.2）pg/mg，Group B （4015.6±427.1）pg/mg，Group C（2838.5±298.9）pg/mg］，IL-6［Group A（664.4±63.5）pg/mg，Group B（2414.8±155.1）pg/mg，Group C（1325.8±56.4）pg/mg］，TNF-α［Group A（149.5±7.8）pg/mg，Group B（546.0±72.6）pg/mg，Group C（286.2±18.6）pg/mg］.MCP-1，IL-1α，IL-6 and TNF-α of group B and group C were significantly higher than group A.MCP-1，IL-1α，IL-6 and TNF-α of group C were significantly reduced than group B.Conclusion The mechanism of the effect of ursolic acid is through inhibition of NF-κB activation，and then inhibit the expression of MCP-1，IL-1α，IL-6 and TNF-α.It can effectively inhibit the restenosis of vein graft that ursolic acid be early administrated after operation.

Coronary artery bypass graft；Restenosis；Ursolic acid

广东省医学科研基金项目（项目编号：A2015433）

510000 广东省广州市，武警广东省总队医院心外科（刘盛华、李彬、邹增晓）；广州中医药大学第一附属医院新生儿科（刘小利）

10.3969/j.issn.1672－5301.2016.08.021

Q95-33；R541.4

A

1672-5301（2016）08-0755-03

2016-03-17）