投加高效聚磷菌P2的污泥驯化及其微生物群落变化的研究

方春玉,周　健,明红梅,赵兴秀,陈蒙恩,姚　霞

(四川理工学院生物工程系,四川自贡 643000)



投加高效聚磷菌P2的污泥驯化及其微生物群落变化的研究

方春玉,周健,明红梅,赵兴秀,陈蒙恩,姚霞

(四川理工学院生物工程系,四川自贡 643000)

将高效聚磷菌菌株P2扩大培养后投加到原有污泥当中,通过CASS反应器按照菌株P2的最佳除磷条件进行驯化,并对驯化过程中的相关污水排放指标进行检测,然后对污泥抗冲击能力进行考察,研究其在不同温度、时间、pH及反应参数下的除磷能力,最后对原有污泥及驯化后污泥中微生物的总DNA进行提取,并利用PCR-DGGE变性梯度凝胶电泳技术对其微生物群落结构进行分析。结果表明,当驯化进行到15 d时,出水中磷酸盐含量等各项指标基本趋于稳定,结束第一阶段驯化。驯化系统适宜的pH7.0、适宜的温度为35 ℃,运行中厌氧好氧交换的频率以20 min为宜,且厌氧释磷时间为1.5 h,此条件下,磷的去除率高达93.6%。在最佳驯化条件下,一些原本在群落中不占优势的聚磷类微生物如聚磷菌P2,经过驯化后能更好适应环境逐渐占据优势地位,活性污泥驯化前后群落结构发生了较大变化。

聚磷菌,污泥驯化,污泥微生物,微生物群落变化

含磷废水中,聚磷菌是活性污泥除磷的主力军,因此,要想提高活性污泥的除磷能力,就必须提高聚磷类微生物在活性污泥中所占的比例及除磷能力[1]。活性污泥的驯化过程中,微生物群落变化直接反映出添加菌的适应能力和适应条件,这使得在实际的应用中,污泥驯化及系统的处理能力变得极易控制。目前,不少研究者对废水处理工艺和设备进行改进,以期提高废水处理效率;也有人在采用生物强化手段,但污水处理系统中污泥活微生物量少、污泥活性低、处理能力弱、处理不稳定[2-4]。本研究拟通过投加高效聚磷菌菌种,找到高效菌株的最佳适应和代谢条件,探寻污泥驯化前后微生物群落的变化规律,以期提高含磷污水系统中磷元素的去除效率、增加污泥的抗冲击能力,从而稳定污水处理系统的处理能力。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

菌种从泸州老窖股份有限公司罗汉污水处理站CASS反应池污泥中分离的菌株柠檬酸杆菌P2(Citrobactersp);本实验所用的活性污泥取自泸州老窖罗汉污水处理站CASS曝气池;实验用水取自罗汉污水处理站中间水池废水添加一定量的化学试剂,添加比例及水质特征见表1所示;营养培养基牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、KH2PO415 mg,蒸馏水至1000 mL、pH7.2～7.4。

表1　配制废水成分及最终水质特征Table 1　Composition and quality characteristics of configuration waste water

868型精密pH计热电上海;ST16R恒温高速离心机美国Thermo;CTL-12化学需氧量速测仪承德市华通;5B-6P总磷测定仪上海连华;55i+Ds-SM-U1生物显微成像系统日本NIKON;SCAN1200影像分析菌落计数仪上海智理;C1000 PCR扩增仪美国BIORAD;721BRO3125凝胶成像仪美国BIORAD;374BR4168 DGGE电泳仪美国BIORAD;MODEL474 DGGE凝胶进样器美国BIORAD;MILLI-Q超纯水仪美国Millipore。

1.2实验方法

1.2.1污泥驯化及相关条件控制驯化装置为30 L的圆柱形玻璃容器,通过下方水浴锅进行恒温控制。将之前扩大培养后的高效聚磷菌P2按照1∶1量(体积比)投加到装有污泥的驯化装置中,用恒流泵从驯化装置底部循环进水[5-7],并依据前期研究的聚磷菌最佳除磷生长条件研究结果,将污泥培养条件尽量接近聚磷菌最佳代谢条件,即P2的最佳除磷条件为时间10.51 h、初始COD浓度494.52 mg/L、初始pH7.0、初始TP 50 mg/L、温度35 ℃,使其在活性污泥中占据一定比例,期间必然会引起整个群落结构的变化,甚至会造成活性污泥整体除污能力的改变,驯化期间将温度控制在35 ℃左右,pH调至7.3左右,驯化时间直至出水各指标达到稳定为止。

实验采用静止1.5 h、曝气3.5 h、沉淀0.5 h后排水至设计排水高度(15 cm),后加相同水质废水至第一轮驯化的相同刻度,约25 L,进行下一轮驯化,这一驯化时间段每天对水样除磷率、COD、MLSS等浓度进行测量,直至各参数基本保持稳定,结束驯化。

1.2.2活性污泥除磷效果的研究对驯化后好氧活性污泥除磷性能及抗冲击能力进行研究,主要考察温度、pH、好氧/厌氧交替频率及厌氧时间对活性污泥除磷效果的影响。

1.2.2.1pH的确定采取培养温度为35 ℃,进水TP浓度为10 mg/L左右,厌氧时间为1.5 h,好氧时间为4 h,沉淀时间为0.5 h,其它条件不变的情况下,将进水pH分别控制为6、7、8、9,以考察不同pH下的除磷效果。

1.2.2.2温度的确定由于在实际工艺当中要处理的废水量较大,且具有一定温度(一般为35 ℃左右),又由于冬夏季气温变化较大,综合实际情况,选择温度25、30、35、40 ℃进行实验,其它实验条件为厌氧时1.5 h,好氧3.5 h,沉淀0.5 h,进水pH为7,进水TP浓度为10 mg/L左右。考察不同温度下活性污泥的除磷能力。

1.2.2.3运行参数的确定反应器运行参数的控制在于找出最佳除磷参数,以便节约能源及时间,增加反应器的利用率,主要为厌氧时间及厌氧好氧交替频率的控制。按污泥驯化培养条件,改变不同的交替时间10、20、30 min,考察聚磷菌除磷效果。

本实验选取厌氧时间分别为1、1.5、2 h,好氧时间为3.5 h,进水TP浓度为10 mg/L左右,温度为35 ℃,pH7.0左右进行实验。

1.2.3分析检测方法COD利用COD快速测定仪测定;TP采用钼酸铵分光光度法(GB 11893-89)测定;NH4-N采用氨氮测定仪直接测定；pH利用精密pH测定;MLSS、SVI采用量筒直接测量法;DNA的提取、DNA含量测定、电泳、染色等试剂的配制及操作参考文献[8-15]。

1.2.4活性污泥微生物群落结构分析

1.2.4.1活性污泥中微生物总DNA提取和纯化取原始污泥和驯化至出水稳定后(15 d)的活性污泥液1 mL分别接种于营养培养基中,于30 ℃、150 r/min的摇床内过夜培养,之后按照如下方法对活性污泥中混菌基因组总DNA进行提取。提取步骤为:菌体收集—辅助裂解— 除蛋白—抽提—离心—风干[5-12]。

1.2.4.2DNA检测利用核酸蛋白仪分别对驯化前后活性污泥中所提取的总DNA的OD260 nm/280 nm、OD260 nm/230 nm进行测定,从而确定所提取的活性污泥驯化前后菌落总DNA的含量及纯度。

1.2.4.3PCR扩增以纯化后的基因组DNA为模版进行PCR扩增,引物采用细菌16S rDNA基因V3区的引物F341(5′ CCTACGGGAGGCAGCAG3′)和R518(5′ ATTACCGCGGCTGCTGG3′),其扩增体系见表2。

表2　PCR扩增体系Table 2　The system of PCR amplification

PCR扩增程序:94 ℃预变性94 ℃ 4 min、65 ℃ 40 s(退火)72 ℃ 40 s,1 min(返回至第二步,21个循环,每个循环中退火温度下降0.5 ℃)94 ℃、65 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s,1.5 min(返回至第五步,10个循环)72 ℃、12 ℃ 10 min、4 ℃ 20 min暂停;通过1.0%的琼脂糖凝胶电泳对扩增结果进行检测。

2　结果与分析

2.1污泥驯化

通过第一阶段污泥驯化,直至各参数基本保持稳定,结束驯化,每天对水样TP去除率、COD、MLSS等浓度进行测量,结果见图1。

图1　驯化第一阶段出水水质变化情况Fig.1　The variation of quality characteristics of waste water during the first stage of sludge domestication

经过15 d的驯化,出水中COD、除磷率及MLSS浓度等指标基本趋于恒定,比较于初始指标,效果显著(p<0.05),期间污泥由黑色逐渐变为褐色,且沉降性能良好,MLSS稳定在1000 mg/L左右,结果如图2所示。

图2　污泥驯化前后形态图Fig.2　The shape of sludge acclimation before morphological 注:a驯化前,b驯化后。

从图2可知,经过一段时间的驯化,聚磷菌开始逐渐适应环境而不断增殖,这个周期性过程体现了厌氧释磷和好氧吸磷的典型聚磷菌代谢特征,这一特征表明驯化污泥已经具备较高除磷能力。经过15 d的驯化,污水中出水TP浓度由开始的10.0 mg/L左右降至0.2 mg/L左右,磷的去除率由开始的不足20%逐渐上升并稳定在95%以上,磷去除效果显著(p<0.05),说明第一阶段驯化已经顺利完成。从图2可知,经过15 d的驯化,污泥由刚开始的絮凝态逐步转化为颗粒状。

2.1.1pH对活性污泥除磷效果的影响由于工业废水的pH处在动态变化过程,通常在pH=6～9之间变化,个别偏低或偏高,可用酸碱进行适当调节。而本厂废水一般呈酸性,因此对于pH较低的废水可加废碱进行调节,使曝气池进水pH维持在7左右。事实上,活性污泥本身具有一定的抗冲击能力,原因在于其中的微生物对pH的变化具有一定的适应能力,通常曝气池中的pH维持在6.5～8.5之间,且大多数细菌、藻类、放线菌等能够相互凝聚而形成絮状物,从而达到良好的净化效果。结果见图3。

图3　pH对活性污泥除磷效果的影响Fig.3　Effects of pH on phosphorus removal by activated sludge

从图3结果可以看出,在厌氧段,活性污泥在进水pH不同情况下的释磷情况有所不同,pH为7、8时磷的释放速度比较快,效果明显(p<0.05);当pH为6时,因水质偏酸,一些微生物会出现自溶现象,致使一些细胞内磷酸盐在酸性环境下溶解,这就造成了其在厌氧释磷阶段释放速度快且释磷量大,其释磷速度和量远远超过pH为7和8时,但由于活性污泥自身具有一定抗冲击能力,所以在后期好氧吸磷阶段虽受影响,但仍具有一定除磷能力;而当pH为9时,磷的释放因受到抑制而出现先吸收后释放的现象[16],这可能是由于进水成碱性,导致厌氧段生成了一些磷酸钙、磷酸镁沉淀,从而造成水中成了磷含量的暂时性下降。通过综合比较可知,当进水pH为7、8时,比较有利于聚磷菌对磷元素的吸收,其除磷率分别可达93%、89%。

2.1.2温度对活性污泥除磷效果的影响考察温度对活性污泥除磷效果的影响,结果见图4。从图4可知,在一定范围的不同温度条件下活性污泥都有比较好的除磷效果,也说明了活性污泥当中存在适应不同温度条件的聚磷菌种类。在整个除磷工艺中,温度对厌氧阶段的释磷能力影响较大。从图4中结果还可以看出,高温有利于提高磷的释放速率,且在一定温度范围内,随着温度的升高除磷率会不断得到增加,增加值非常明显(p<0.05),但不能超过有效除磷的温度上限。但温度在40 ℃时,由于厌氧段会大量释磷,如果要达到同样的除磷效果,必然要延长曝气时间,这样不但会导致处理周期延长,而且还会多增加一定能耗。所以就温度条件而言,将其控制在35 ℃左右较为理想。

图4　温度对活性污泥除磷效果的影响Fig.4　The effects of temperature on phosphorus removal rate of activated sludge

2.1.3反应器不同运行参数对活性污泥除磷效果的影响活性污泥法的曝气方式通常可分为限制性曝气、半限制性曝气、非限制性曝气三种,其处理效果及能耗各不相同。本研究在曝气方式上采用厌氧/好氧交替的限制性曝气方式,重在研究相同周期内厌氧/好氧交替频率对活性污泥除磷效果的影响。在其它条件基本不变情况下,通过改变厌氧/好氧交替时间(分别取10、20、30 min)进行实验,结果见图5。

图5　不同交替频率对活性污泥除磷效果的影响Fig.5　The variation of phosphorus removal rate in the different time between aerobic and anaerobic

从图5结果可以看出,由于厌氧/好氧环境交替频率的不同混合液中总磷含量呈现上下波动现象,但整体呈现下降趋势。通过比较不同交替频率下除磷效果可以发现,不同间隔时间对活性污泥除磷效果大小依次为20 min>10 min>30 min,且当间隔时间为10 min和20 min时除磷效果相差不大(p>0.05),这说明适当提高厌氧好氧交替频率可以提高活性污泥除磷效果,但并非越高越好,因为交替频率过高可会能出现出水中总磷浓度略微偏高的现象,并且会导致操作麻烦和影响设备正常使用寿命。因此,对于好氧活性污泥除磷而言,将厌氧好氧交替频率提高到满足活性污泥中功能菌正常生长即可。

2.1.4不同厌氧时间对活性污泥除磷效果的影响释磷是吸磷的前提,厌氧阶段磷的释放量越大,好氧阶段对磷的吸收能力就越强,出水中磷的浓度就越低,处理效果就越好。所以,为了达到理想的除磷目的,必须对厌氧时间进行合理的控制,对于不同厌氧阶段下聚磷菌的处理效果见图6。

图6　厌氧时间对活性污泥除磷效果的影响Fig.6　The variation of phosphorus removal rate of activated sludge in different anaerobic time

从图6结果可以看出,在厌氧开始的0.5 h内磷浓度的变化比较大,此后厌氧时间内磷浓度会继续升高,但上升幅度不是很大;在相同条件下,厌氧2 h左右时污水中磷浓度最高,可达到18.76 mg/L,效果非常明显(p<0.05);相同曝气时间4.5 h后,不同厌氧时间1、1.5、2 h的出水中磷浓度分别为1.32、0.43、1.43 mg/L。由于聚磷菌进行生物除磷需要水中具有足够的可降解有机物,当厌氧时间过长时,厌氧微生物会过量消耗水中的可降解有机物,最终会导致水中有机物质消耗殆尽,磷去除率趋于平稳(p>0.05),这就造成了在好氧曝气阶段聚磷菌不能过量吸磷,导致出水中总磷含量过高,达不到排放标准[17]。所以,选择厌氧时间适当即可,一般1.5 h足可达到释磷充分,实现较好的除磷效果。

在最优化条件下,比较原始污泥和添加聚磷菌对废水中磷的去除效果,结果如图7所示。由图7可以看出,投加聚磷菌后污泥的除磷能力提高了13.7%,去除效果非常明显(p<0.05)。

图7　添加原始污泥和驯化污泥对废水中磷去除效果的比较Fig.7　The caparation of phosphorus removal rate in adding different sludge system

2.2污泥微生物群落变化

对反应器中活性污泥进行DNA的提取和纯度检测,结果如表3所示。

表4　细菌DGGE图谱的分析结果Table 4　The analysis results of the bacterial 16S rDNA partial gene DGGE

注:ND未检测到条带,各组内数值表示微生物所占相对百分比;组1表示驯化后污泥,组2表示原有污泥。

DNA扩增后结果见图8所示。将扩增后的DNA进行电泳染色后,结果如图8(b)所示。不难看出驯化后比驯化前可检测到的条带数量发生了改变,部分相同条带更粗更亮。分析原因,可能是系统条件满足部分微生物(如聚磷菌P2)生长代谢条件,快速生长繁殖,数量增加;这类微生物成为优势菌株后,对其他细菌的生长具有一定的抑制作用,导致部分微生物数量减少。驯化前后,系统中细菌种类和数量有明显的变化。

表3　DNA含量及纯度检测Table 3　Testing the DNA of content and purity

图8　16S rDNA V3 PCR扩增结果 和16S rDNA基因DGGE电泳图Fig.8　16S rDNA V3 PCR amplification results and DGGE analysis of bacterial 16S rDNA regions 注:a.扩增图,b.电泳图;条带最上方的 1表示驯化后污泥;2表示原有污泥。

对电泳后的条带进行量的测定,得到表4的结果。污泥驯化前后一些细菌的量发生了较大的改变。图表中不同条带分别代表不同细菌种类,条带数量和亮度分别指代细菌的种类和数量。从图8b中可以看出,活性污泥在驯化前后条带差异较大,驯化后比驯化前可检测到的条带较多且较亮,说明驯化后一些原本在群落中不占优势的微生物因生存条件的改变而逐渐占据优势,尤其是一些具有聚磷能力的微生物如菌株P2,因条件的适应而快速繁殖,从而提高了活性污泥整体的除磷能力。

对电泳后的条带进行切胶测序,结果见表4所示。由表4可以看出,污泥中聚磷菌P2(Citrobacter sp)为3号条带,其数量有了较大的提高,含量从7.9%提高到14%。

3　结论

通过投加菌种及控制反应条件对活性污泥进行驯化。经过15 d的驯化,污泥从原有的灰黑色逐渐变为黄褐色,并由之前的絮凝状态逐渐转化为颗粒状体,活性污泥的除磷能力得到了大幅度提升。

对驯化后活性污泥的相关性能进行研究。结果表明:当进水pH为7.0,有利于聚磷菌对磷元素的吸收;将温度条件控制在35 ℃左右较为理想;厌氧好氧交替频率20 min,释磷阶段将厌氧时间控制在1.5 h有助于磷的较好去除。

对驯化前后活性污泥中微生物群落结构进行研究,结果表明,活性污泥驯化前后微生物群种类和数量都发生了较大变化,一些原本在群落中不占优势的聚磷类微生物如聚磷菌P2,经过驯化后能更好适应环境逐渐成为优势菌株数量得到了增加,优势菌势必对部分不适应环境的微生物生长具有抑制作用,导致这类微生物数量的减少甚至消失。在废水处理系统中投加高效聚磷菌,能较好的发挥聚磷菌的聚磷效果,从而有效提高了含磷废水的除磷效果。

[1]李海峰,李志建,屈建航.高效聚磷菌的分离、筛选与构建的研究进展[J].生物技术,2012(4):93-97.

[2]令云芳,王淑莹,王伟,等.厌氧段 HRT对A2N工艺反硝化除磷脱氮效果的影响[J].水处理技术,2006,32(10):44-47.

[3]陈世年.焦化废水活性污泥中微生物生态学研究[J].华侨大学学报:自然科学版,1994,15(2):217-219.

[4]郭静波,马放,魏利,等.微生物菌剂的生态构建及其在污水处理中的应用[J].中国给水排水,2013,29(15):76-80.

[5]Kargi F. Enhanced biological treatment of saline waste-water by using halophilic bacteria[J]. Biotechnology Letters,2002,24(19):1569-1572.

[6]Bieszkiewicz E,Boszczyk-Maleszak H,Wlodarczyk A,et al. Studies on the effect of inoculation of activated sludge with bacteria actively degrading hydrocarbons on the biodegradation of petroleum products[J]. Acta Microbiologica Polonica,2002,51(3):285-292.

[7]Kargi F,Ozmhc S. Improved biological treatment of ni-trogen-deficient wastewater by incorporation of N2-fixing bacteria[J]. Biotechnology Letters,2002,24(15):1281-1284.

[8]韦进宝,吴峰主编.环境监测手册[M].北京:化学工业出版社,2006.

[9]戴淑萍.处理成熟垃圾渗滤液的生物反应器微生物群落结构DGGE分析[D].上海:华东师范大学,2012:39-41.

[10]Maneerat Khemkhao,Boonyarit Nuntakumjorn,Somkiet Techkarnjanaruk. UASB performance and microbial adaptation during a transition from mesophilic to thermophilic treatment of palm oil mill effluent[J]. Journal of Environmental Management,2012,103(30):74-82.

[11]冯广达,邓名荣,郭俊,等.利用 PCR-DGGE 溯 源典型农村塘坝饮用水中的污染[J].环境科学学报,2011,31(3):468-475.

[12]郭飞宏,郑正,张继彪,PCR-DGGE 技术分析塔式蚯蚓生态滤池微生物群落结构[J].中国环境科学,2011,31(4):597-602.

[13]Ensiyeh Taheri,Mehdi H Khiadani. Treatment of saline wastewater by a sequencing batch reactor with emphasis on aerobic granule formation[J]. Bioresource Technology,2012,111:21-26.

[14]何金妹.反硝化除磷过程微生物群落演替分析[D].广州:广州大学,2013.

[15]邢文慧.剩余污泥合成PHB营养条件及菌种组成分析[D].哈尔滨:东北林业大学,2013.

[16]徐亚同编著.废水中氮磷的处理[M].上海:华东师范大学出版社,1996.

[17]许保玖,龙腾锐.当代给水与废水处理原理[M].北京:高等教育出版社,2000.

Research on the sludge domestication by adding high effective phosphorus-accumulating bacterium P2and the change of the sludge microbial community

FANG Chun-yu,ZHOU Jian,MING Hong-mei,ZHAO Xing-xiu,CHEN Meng-en,YAO Xia

(Biotechnology Engineering Dept,Sichuan University of Science & Technology,Zigong 643000,China)

In order to make the phosphorus removal ability of the activated sludge in the original process further improved,the strain P2was added to the original sludge after expanding culture,then through CASS reactor according to the approximation optimal phosphorus removal conditions to the strain P2was domestication,and to detect the related sewage discharge index in the domestication process. When domesticated conducted to 15 d,the various indicators of effluent as phosphorus removal rate were basically stable,ending the first phase of domestication. Then inspect the sludge impact resistance,study on in different temperature,time,pH value and reaction parameters to the phosphorus removal ability,the results showed that the suitable pH was 7.0,a suitable temperature was 35 ℃,the change frequency was 20 min between the anaerobic and aerobic,and the anaerobic time was 1.5 hours. which the phosphorus removal rate reached 93.6%.In the optimum domesticated conditions,some phosphorus accumulating organisms,was not dominant in previous sludge,such as the strain p2,were due to be changed to the main organisms after being domesticated,the activated sludge microbial community structure changed greatly.

phosphorus-accumulating;sludge domestication;sludge microorganisms;the change of microorganisms community

2015-11-12

方春玉(1977-),女,硕士研究生,高级实验师,主要从事环境生物技术方面的研究,E-mail:471315625@qq.com。

酿酒及生物技术四川省重点实验室项目(NJ2014-05);泸州老窖科研奖学金项目(15ljzk06);四川省大学生创新基金项目(201510622061);四川理工学院培育项目(2015PY02)。

TS261.9

A

1002-0306(2016)14-0196-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.031