乳酸菌胞外多糖的分离纯化和结构解析

王荣平,图布兴吉雅,郝　娜,李相沂,乌云达来

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018)



乳酸菌胞外多糖的分离纯化和结构解析

王荣平,图布兴吉雅,郝娜,李相沂,乌云达来*

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018)

乳酸菌胞外多糖具有独特的理化性质和生物学活性,对其理化性质和结构进行研究并阐明结构与功能的关系具有重要的意义。本文介绍了乳酸菌胞外多糖的分类及组成,针对目前胞外多糖的分离纯化方法、理化性质测定方法、结构鉴定方法进行了详细描述,并对今后胞外多糖的研究内容和研究方向进行了展望。

乳酸菌,胞外多糖,分离纯化,理化性质,结构鉴定

许多乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)在生长代谢过程中向细胞外分泌长链多糖聚合物,称为胞外多糖(Exopolysaccharides,EPSs)。根据多糖和菌体的依附关系,EPSs可分为黏液多糖(slim polysaccharides)和荚膜多糖(Capsular polysaccharides,CPSs)[1],黏液多糖是指形成黏液层松散的附着于菌体表面或分泌到菌体所处环境中的多糖,荚膜多糖与黏液多糖结构类似,但形成荚膜长久紧密地结合在菌体表面[2-3]。乳酸菌作为益生菌,具有免疫调节、抑制胃肠道病原菌等多种生物活性[4],其所产EPSs因来源安全、类型多样、性能优异等特点受到人们的广泛关注。乳酸菌EPSs可作为增稠剂、稳定剂、乳化剂、胶凝剂等应用于食品、医药和化工行业[5]。此外,研究发现EPSs还具有改善肠道微生态[6]、抗肿瘤[7]、免疫调节[8]、降低血液胆固醇[9]等生物活性。因此,对乳酸菌EPSs进行分离纯化,明确其理化性质和分子结构,为解析EPSs结构与功能的关系及进一步的开发EPSs产品奠定基础,具有重要的意义。本文从乳酸菌EPSs的分类及组成,当前乳酸菌EPSs的分离纯化方法、理化性质测定方法、初级结构和高级结构鉴定方法等几个方面进行阐述,并简单介绍了计算机程序(CASPER)在乳酸菌EPSs结构鉴定方面的应用,最后对今后乳酸菌EPSs的研究内容和研究方向进行了展望。

1　乳酸菌胞外多糖的分类及组成

乳酸菌分泌的EPSs在组成、结构、分子量和空间构象等方面都不相同[10]。但根据单糖组成和生物合成途径分为两类[11]:同多糖(Homopolysaccharides,HoPS)和杂多糖(Heteropolysaccharides,HePS)。HoPS由同一种类型的单糖组成的重复单元构成,有四种类型[12]:α-D-葡聚糖(α-D-glucans),如肠膜明串珠菌亚种(L.mesenteroidessubsp.Mesenteroides,L.mesenteroidessubsp.dextranicum)等合成的右旋糖酐(dextrans),主链由α-1,6糖苷键连接,在2,3,4位有不同程度的分支[13]。β-D-葡聚糖(β-D-glucans),由β-1,3键连接的葡萄糖主链和β-1,2键连接的侧链构成,如可得然胶(curdlan)为直线型的中性葡聚糖,仅含β-1,3糖苷键,无分支或取代基[14]。果聚糖(fructans),链球菌属(S.salivarius,S.mutans)、明串珠菌属(L.mesenteroides),乳杆菌属(L.sanfranciscensis,L.reuteri)等可产生果聚糖(Levan),主链由β-2,6糖苷键连接,侧链由β-2,1糖苷键连接[15]。其它,如半乳聚糖(polygalactan),由结构相同的重复单元(不同糖苷键连接)构成,有时有分支,单糖为α-D-半乳糖或β-D-半乳糖[12]。同多糖的分子量很大,可达107u[12]。

表1　一些常见乳酸菌产生的杂多糖Table 1　Heteropolysaccharides produced by some common strains of lactic acid bacteria

注:a:Glc:葡萄糖;Fru:果糖;Gal:半乳糖;Man:甘露糖;Rha:鼠李糖;ManNAc:N-乙酰基-D-甘露糖胺;b:p:吡喃糖;f:呋喃糖;c CASPER:常规多糖的计算机辅助光谱评估。

HePS由两种或两种以上不同类型的单糖组成的重复单元构成,重复单元从三聚糖到八聚糖不等,单糖主要是D-葡萄糖、D-半乳糖及L-鼠李糖,在不同菌种产生的HePS中的比例不同,有的只含其中的一种或两种[2-16]。有时重复单元中也会出现果糖、甘露糖、海藻糖、阿拉伯糖、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、糖醛酸、非糖取代基(如磷酸基、乙酰基、甘油等)等[3-17],Patten等[18]首次发现L.helveticussp. Rosyjski所产EPS含有N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)。不同乳酸菌产生的杂多糖在分子量、单糖组分、重复单元、取代基类型、连接键型、主链及支链的结构、空间构型等方面均存在一定的差异。杂多糖的分子量在1.0×104～6.0×106u之间,小于同多糖,且其产量也小于同多糖[3-16]。结冷胶(gellan)、黄原胶(xanthan)、开菲尔多糖(kefiran)是典型的杂多糖。其中,开菲尔多糖是水溶性的杂多糖,包含大约相等比例的葡萄糖和半乳糖[19]。一些常见乳酸菌的HePS见表1。

2　乳酸菌胞外多糖的分离纯化

乳酸菌EPSs分离纯化操作的复杂程度取决于发酵培养基的成分。通常操作包括离心除菌体、上清液脱除蛋白质、沉淀分离EPSs、对EPSs进行纯化等操作。除蛋白质时,多用三氯乙酸(TCA)法、酶解法、Sevag法,或者结合使用,用TCA法除蛋白质时,应注意pH和温度,以减少TCA对多糖的降解;沉淀EPSs时,常用乙醇、丙酮等有机溶剂;后期的纯化包括透析、膜过滤等。多糖产量可用冻干得到的干粉的质量表示或用苯酚-硫酸法[27]测定溶液中的总糖含量。此外,因有些乳酸菌能合成一种类型以上的EPSs,因此还需对EPSs进行分级纯化,常用方法有色谱法、透析法、电泳法、超滤法等[28]。色谱法中离子交换色谱法和凝胶色谱法使用最多,原理基于EPSs组分所带电荷和分子量的不同:根据离子强度不同进行初步分离,可得到电荷单一的组分,再通过分子量的不同进行二次分离,最终得到电荷和分子量均单一的EPS。常用的离子交换剂多为纤维素阴离子交换剂,如二乙基氨基乙基(DEAE-cellulose、DEAE-Sephadex、DEAE-Sepharose)、羧甲基(CM)等,常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex G系列)、琼脂糖凝胶(Sepharose 系列)、聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶(Sephacryl)等。Wang等[29]通过离心除菌体、终浓度4%(w/v)的TCA除蛋白、75%(v/v)乙醇4 ℃沉淀多糖、透析、冻干等操作从MRS培养基得到L.plantarum粗多糖r-EPS后,分别以不同浓度的NaCl溶液和去离子水为洗脱液,进行DEAE-52和SephadexG-100层析柱洗脱,最终得到两个组分r-EPS1和r-EPS2;Li等[30]采用类似的方法从乳清培养基中分离得到三种L.helveticus胞外多糖组分EPS-1、EPS-2和EPS-3;Gorska-Fraczek等[26]通过乙醇沉淀多糖,脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶和蛋白酶除蛋白质、核酸杂质等操作从MRS培养基得到L.johnsonii粗EPSs,再分别以20 mmol/L Tris缓冲液和0.1 mmol/L乙酸铵缓冲液为洗脱液,进行DEAE-Sephadex A-25和TSK HW-55S层析纯化,得到一个EPS组分。但Ibarburu等[31]将半定义培养基发酵液离心去L.suebicus菌体后,利用乙醇对多糖进行分级沉淀,得到F和P两个EPS组分;Dilna等[32]先进行离心去菌体、乙醇反复沉淀的操作从MRS得到L.plantarum粗EPSs,再使用苯酚∶三氯甲烷∶异戊醇=25∶24∶1的溶液分级纯化多糖。

获得单一的EPS组分之后,还须鉴定其纯度,因为多糖纯品是一定分子量范围的均一组分,只代表相似链长的平均分布,其微观也存在不均一性。常用的测定方法有超离心法、旋光测定法、电泳法、色谱法等。若多糖为纯品,使用色谱法时出现单一的洗脱峰且峰形尖锐、对称,电泳时得到单一斑点。

对EPSs进行分级纯化时,色谱法分级效果要好于有机溶剂分级沉淀,但EPSs的回收率低,耗时长,操作繁琐,如Wang等[29]得到的L.plantarum两个EPS组分的回收率分别为45.2%和10.9%,Li等[30]得到的三种L.helveticusEPS组分的回收率分别为28.2%、39.5%和2.4%。在多糖纯度鉴定方面,分子排阻高效液相色谱法的分辨率高于常压凝胶过滤色谱法,可以避免常压色谱由于分辨率低造成的高纯度假象[33]。对EPSs进行分离纯化应根据发酵液的性质和实际情况进行。

3　乳酸菌胞外多糖的理化性质测定

乳酸菌EPSs的理化性质与其生物活性密切相关,因此对其理化性质的研究也是必不可少的,EPSs的理化性质包括纯度,总糖含量,蛋白质含量,糖醛酸含量,硫酸基含量,相对分子质量,单糖组成,相对粘度,溶解性,对热、酸、碱的稳定性、电荷密度等。其中,蛋白质含量测定主要使用考马斯亮蓝法、Folin-酚法、紫外吸收法等;糖醛酸含量测定有硫酸-咔唑法、间羟基联苯法;硫酸基含量测定有氯化钡-明胶比色法、盐酸水解-硫酸钡法等;相对分子质量的测定主要是色谱法,如高效液相色谱法、凝胶色谱法等;单糖组成测定主要为气相色谱法,因单糖较难气化,所以需将单糖衍生化,常用方法有糖腈乙酸酯衍生化法、三甲基硅醚衍生化法、糖醇乙酸酯衍生化法;乳酸菌EPSs对热、酸、碱等的稳定性有利于保持食品在加工过程中的稳定性。

4　乳酸菌胞外多糖的结构鉴定

4.1一级结构鉴定

解析乳酸菌EPSs结构是研究其构效关系和结构修饰的基础,沿用蛋白质的分类方法,EPSs的结构也可分为一、二、三、四级。一级结构的鉴定包括以下内容:糖链分子量、单糖组成及分子摩尔比、单糖残基的D-型/L-型、糖环形式(呋喃环/吡喃环)、单糖残基构型(α-/β-)、连接位置、单糖残基间的排列顺序、糖链中侧链的分支点,糖链与非糖部分的连接方式等。研究方法可分为物理学、化学、生物学等多种。物理学方法有紫外光谱、红外光谱、核磁共振波谱、液/气相色谱、质谱、气质联用等;化学方法有酸水解、甲基化、高碘酸氧化、Smith降解等;生物学方法有酶解、免疫反应等。以下主要介绍红外、核磁共振和甲基化在EPSs结构解析中的原理和应用。

红外光谱(Infrared Spectrum IR)分析多采用KBr压片法,结合傅立叶变换红外光谱进行4000～400 cm-1范围扫描:根据红外光谱的“指纹性”,多糖分子中O-H和分子内或分子间氢键的伸缩振动在3600～3200 cm-1处出现宽而强的吸收峰,C-H伸缩振动在3200～2800 cm-1处出现强吸收峰,这两个吸收峰是多糖类物质的特征峰[22-34]。1200～950 cm-1被认为是EPS的指纹区:若含吡喃糖环,在1200～1000 cm-1应存在三个吸收峰,若含呋喃糖环,在相应区域只出现两个峰[32]。另一方面,糖的α-和β-端基差向异构体是由端基的C-H变角振动造成的,α-型的C-H在(844±8) cm-1处有吸收峰,β-型的C-H在(891±7) cm-1处有吸收峰。此外,亚甲基在2930～2850 cm-1处有弱吸收峰,羧基的C=O非对称伸缩振动在1700～1600 cm-1处有强吸收峰,硫酸基的S=O伸缩振动在1240～1230 cm-1处有吸收峰等[35]。因此,红外光谱可以鉴别EPSs中不同的单糖,识别呋喃糖和吡喃糖,确定糖苷键构型,识别主要的取代基。

核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance NMR)在EPSs的结构鉴定中起着非常重要的作用,可以测定糖链中糖基单元的种类和比例,确定糖苷键的构型和连接方式等。常用的有1H-NMR、13C-NMR和2D-NMR。在1H-NMR波谱中,通常糖异头质子H-1的化学位移(δ)约在4.5～5.3 ppm,该区域内的质子信号个数相当于EPS单糖组分的异头质子个数[32],同时α-型吡喃糖H-1的质子δ>4.95 ppm,β-型吡喃糖H-1的质子δ<4.95 ppm,另外,异头质子与其邻位质子的耦合常数(J)也能推断糖环构型,如Polak-Berecka等[25]在1H-NMR谱中结合δH4.655和J1,2=7.6 Hz等推断L.rhamnosusE/N EPS含β-D-吡喃葡萄糖;呋喃糖H-1的质子δ在5.4 ppm左右、J<2 Hz,可区别呋喃糖环和吡喃糖环[34,36-37]。13C-NMR的分辨率远高于1H-NMR,可表现出EPS分子结构上的精细变化,主要用来确定多糖中各残基的种类和比例、糖环上异头碳的构型、多糖残基中取代位置和分支点。一般糖环的异头碳δ位于95～110 ppm,不同糖残基异头碳的化学位移不同,因此信号峰的数量代表了单糖种类个数,另外,根据13C-NMR谱图中峰相对高度正比于碳的数目可计算出不同糖残基的相对比例;通常吡喃糖异头碳,α-型δ为97～102 ppm,β-型δ为103～106 ppm[34-37],但此规律不适用于甘露糖和鼠李糖,如Dilna等[32]判断L.plantarumRJF4 EPS的13C-NMR谱图中69.46和73.22 ppm的强信号是α-D-甘露糖的C4和C5信号,而依靠异头碳与异头质子间的裂分常数(JC-H)可判断它们,α-构型的JC-H在170 Hz左右,β-构型的JC-H在160 Hz左右,此规律仅适用于吡喃糖;多糖残基中羟基发生取代会使异头碳的δ发生移动,据此判断多糖残基中的取代位置和分支点。

甲基化分析的基本原理是将多糖糖基上的游离羟基全部甲基化后,进行酸水解,对水解产物进行还原、衍生化、GC-MS方法结合标准谱图分析来确定各种单糖残基的种类和相对含量,以测定多糖链中各种单糖残基的连接方式[38-39]。可用于分析EPSs中糖苷键连接方式及分支情况,根据不同甲基化单糖的比例还可以推测出该种连接键型在EPSs重复结构中的比例。单糖衍生物的结构可通过其在EI离子源作用下的裂解规律来推断。需要注意:多糖必须完全甲基化,可用红外光谱检测甲基化产物在3400 cm-1附近羟基峰吸收情况,如果仍有羟基峰存在,则表示甲基化不完全,需重复进行甲基化或将已甲基化的多糖萃取出来做后续处理分析;对于含有糖醛酸、氨基己糖以及某些取代基团的多糖,需要考虑甲基化和酸水解是否会引发副反应[40]。

与化学分析法相比,物理分析法快速、准确、操作方便、灵敏度高、对EPSs样品破坏性小,但是两种方法都有自身的局限性,如GC法分析EPSs时受到样品挥发性和热稳定性的限制,需要对样品进行衍生化处理,核磁共振结果与甲基化结果相结合,可弥补各自的缺陷,更加准确地反映多糖的真实结构等。同时由于EPSs结构的复杂性,决定了任何一种单一的方法都不可能确定其精细结构,因此需要物理化学等多种方法的结合分析。

4.2高级结构研究

由于EPSs分子量大,结构复杂,鉴定仪器信号复杂叠加的影响,要得到其二级以上高级结构的清晰图谱是比较困难的。目前EPSs高级结构的鉴定方法有二维核磁共振(2D-NMR)、刚果红实验、X射线衍射(XRD)、原子力显微镜(AFM)、圆二色谱(CD)、差示扫描量热法(DSC)、基于高分子稀溶液理论的解析法(动/静态光散射法、黏度法)等。

2D-NMR对复杂有机分子,特别是在溶液中的生物大分子的结构研究中发挥着重要的作用,因其信号间重叠少,又可展示出自旋核间的相互作用,因此相比其它方法能提供更多的结构信息,适合水溶性的乳酸菌EPSs的结构研究。其中,COSY(1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy,化学位移相关谱)中每个交叉峰反映了相邻氢核间的耦合关系,交叉峰的强度与其3J密切相关,强度越大,3J值越大,反之亦然;由于异头质子易于辨认,所以一般从异头质子的对角线峰出发,先找到H-1、H-2的交叉峰,通过划线即可找出H-2的对角线峰,再从H-2的对角线峰出发,依次找到H3～H6的对角线峰和化学位移。TOCSY(Total Correlation Spectroscopy,全相关谱)给出的是同一自旋体系中所有氢核间的相关峰,包括长程耦合和短程耦合,从谱图中任一谱峰出发,能找出许多相关峰,它们与该氢核处于同一自旋体系,如H-1和H-2,H-1和H-3,H-1和H-4等,因而可作为COSY谱的补充和验证。HSQC(Heteronuclear Single-qauntum Coherence,异核单量子相干)反映的是直接相连的1H和13C核间的偶合关系(1JCH),与其余2D谱图结合可以找出与异头碳相连的碳以及糖基上每个质子所连碳的信号。HMBC(Heteronuclear Multiple-bond Correlation,异核多键相关)能把1H核与长程耦合的13C核关联起来,可解决糖残基连接序列问题,这正是2D-NMR的优势所在。NOE效应(Nuclear Overhauser Effect,核欧沃豪斯效应)是指分子内质子与质子在空间相互接近而产生的核交叉弛豫现象,在NOESY谱图中出现NOE相关峰[41-42],可作为COSY的补充来识别谱峰,也可用来确定糖残基间的连接方式。

用2D-NMR分析多糖结构的一般思路为:由碳谱确定异头碳的数目;由异头碳的位移,在HSQC谱中找出异头质子;从异头质子出发,在COSY谱中找出其它氢核的位移;由氢核的位移,在HSQC谱中找出碳的位移;完成氢和碳的归属后,在HMBC谱中找出与某一个糖单元的异头质子和异头碳相关的另一个糖单元的碳和氢,以此推断出糖单元的连接次序[42]。得到多糖的初步结构后,可对照甲基化分析结果,以避免2D-NMR谱中一些噪音峰和杂质峰的干扰。近年来,HMQC-COSY、HMQC-TCOSY、HSQC-TOCSY、HMQC-NOESY等混合多量子谱的发展,用于解决不能用13C-1H COSY或HMQC进行准确归属的问题[38]。计算机程序CASPER(Computer Assisted Spectrum Evaluation of Regular polysaccharides)可快速预测EPSs等类型的多糖的初级结构,通过数据库中储存的单糖到三糖的1H和13C化学位移来预测多糖的化学位移,在此基础上,进一步分析未分配的1D1H和13C NMR及2D1H-1H和1H-13C NMR(如1H,1H-TOCSY,1H,13C-HSQC等),并预测出可能的结构[21,36,43],如Patten等[18]将甲基化分析数据、同核和异核耦合常数、13C-NMR化学位移输入CASPER以确定Lb.helveticussp. Rosyjski EPS中半乳糖残基C5和C6的谱线归属。

此外,刚果红试剂可用来判断EPSs是否具有三股螺旋结构,利用AFM可以观察EPSs分子的微观形态、凝胶网络,XRD可获得EPSs键角、键长、构型角等多方面的分子结构信息,CD可用于测定EPSs分子不对称结构。Shang等[22]利用刚果红实验测定在NaOH浓度为0.05～0.4 mol/L溶液中刚果红和B.animalisEPSb复合物的最大吸收波长,发现EPSb中无螺旋-卷曲转变;邵丽等[44]采用AFM对L.rhamnosusEPS S2在水溶液中的表观形貌进行观察,得到了不同质量浓度的EPS S2聚集行为图像,进一步验证了由高分子稀溶液理论推断的无规卷曲构象的结论。

5　结论与展望

目前世界范围内利用乳酸菌作为发酵菌株的食品有很多,如酸奶等发酵奶制品、发酵香肠等发酵肉制品、泡菜等发酵蔬菜制品等等。目前国内外有许多产EPSs的乳酸菌被分离出来,对EPSs也做了大量的研究,其许多生物活性也被发现。乳酸菌EPSs表现出的多样生物活性是由其结构决定的,因此对乳酸菌EPSs进行分离纯化是结构鉴定的基础,但EPSs分离纯化方法滞后,提取率低,未来应继续改进EPSs的分离纯化方法,提高提取率和纯度;同时由于乳酸菌EPSs类型多样,结构复杂,对其结构的研究还停留在初级结构方面,有的EPSs因结构不明晰,尚不能从分子水平对其生物活性进行深入研究,也无法确立其构效关系。因此,对乳酸菌EPSs结构进行鉴定,特别是对其高级结构和空间构象的研究,阐明结构与功能间的关系是开发和利用乳酸菌EPSs的关键。鉴于此,本文从以上几个方面出发,对近几年乳酸菌EPSs的研究方法进行总结阐述。此外,不同乳酸菌生产EPSs的能力不同,产量普遍较低等,这些都限制了EPSs的应用,应加大高产菌株筛选、基因调控等方面的工作以提高EPSs产量。相信以上这些必将大大促进乳酸菌EPSs在食品、药品、保健品等领域的应用。

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Isolation,purification and structure identification of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria

WANG Rong-ping,Tubuxingjiya,HAO Na,LI Xiang-yi,Wuyundalai*

(College of Food Science and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)

The exopolysaccharides(EPSs)of lactic acid bacteria(LAB)have unique physicochemical properties and biological activities,and it is of great significance to study the physicochemical properties and structure of the EPSs and to elucidate the relationships between structure and function. This review introduced the classification and composition of EPSs,as well as summarized the available information on procedures and methods used for research on this topic. The information provided deals with methods for isolation and purification of EPSs,the physicochemical properties and structure identification. The research contents and orientation in the future were also discussed.

lactic acid bacteria;exopolysaccharides;isolation and purification;physicochemical properties;structure identification

2016-01-04

王荣平(1989-)，男，硕士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail：wangrongping1989@163.com。

乌云达来(1975-)，男，副教授，研究方向：食品微生物，E-mail：wydl@imau.edu.cn。

广谱抗菌活性瑞士乳杆菌AJT所产抗菌物质及发酵提取工艺的研究(20130438)；广谱抗菌活性瑞士乳杆菌AJT产生细菌素的发酵条件优化研究(2014MS0358)。

TS201.2

A

1002-0306(2016)14-0389-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.069