刺五加提取物对牡蛎蛋白酶解产物抗疲劳效果的强化作用

常　格,秦小明,章超桦,陈建平

(广东省水产品加工与安全重点实验室,广东普通高等学校水产品深加工重点实验室,国家贝类加工技术研发分中心(湛江),广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088)



刺五加提取物对牡蛎蛋白酶解产物抗疲劳效果的强化作用

常格,秦小明*,章超桦,陈建平

(广东省水产品加工与安全重点实验室,广东普通高等学校水产品深加工重点实验室,国家贝类加工技术研发分中心(湛江),广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088)

在牡蛎蛋白酶解物中添加具有抗疲劳效果的刺五加提取物,以强化其抗疲劳效果,通过小鼠力竭实验进行评价。将昆明小白鼠随机分为阴性对照组、牡蛎蛋白酶解物组、低剂量刺五加提取物(0.14 g/kg)与牡蛎蛋白酶解物复合组、中剂量刺五加提取物(0.70 g/kg)与牡蛎蛋白酶解物复合组、高剂量刺五加提取物(2.10 g/kg)与牡蛎蛋白酶解物复合组、刺五加提取物组。然后,对每组小鼠灌胃给药4周。通过小鼠力竭游泳实验测定小鼠力竭游泳时间、肝糖原含量、血清尿素氮值、以及血乳酸值四个指标来确定样品的体内抗疲劳效果。结果表明,综合所有抗疲劳指标来看,牡蛎蛋白酶解物组游泳时间(p<0.05)、肝糖原含量(p<0.05)和乳酸含量(p<0.01)这三项指标显示阳性,表明其具有抗疲劳效果。而添加刺五加提取物后,中剂量刺五加提取物(0.70 g/kg)与牡蛎蛋白酶解物复合组在本实验中的一项运动指标及三项生化指标中均显示阳性(p<0.01),这表明,相比单独的牡蛎蛋白酶解物组,中剂量刺五加提取物(0.70 g/kg)与牡蛎蛋白酶解物复合组具有更好的抗疲劳效果。因此可以得出结论,添加中剂量的刺五加提取物确实可以强化牡蛎蛋白酶解物的抗疲劳作用效果。本文研究明确了刺五加提取物可以增强牡蛎蛋白酶解物的抗疲劳效果,为其进一步开发成高效的抗疲劳保健食品提供了可能。

牡蛎蛋白酶解物,刺五加提取物,小鼠力竭游泳实验,抗疲劳效果

疲劳是人经过连续的体力劳动和脑力劳动后,工作能力暂时下降的一种状态[1]。当今社会的快节奏工作生活状态给人们带来了巨大的压力,多数人因为过度的疲劳处于亚健康状态,严重影响了人们的工作效率和生活质量。与此同时,在运动领域和军事领域,由于环境条件的苛刻,对于抗疲劳产品的效果也有较高的要求。因此,高能效的抗疲劳药品及功能食品的研究具有非常重要的意义[2-3]。

作为我国首批列为药食同源的保健疗效食品之一的牡蛎,味道鲜美,具有低脂肪高蛋白的特点,并有“海洋牛奶”的美称[4-5]。吉宏武等人对牡蛎肉水解物营养成分进行分析发现,牡蛎水解物中含有大量的牛磺酸、矿物质等多种具有抗疲劳作用的营养成分,并以动物实验证明近江牡蛎肉水解物有较好的抗疲劳效果[6]。而张骞从牡蛎中提取出的牡蛎糖原也已通过小鼠实验证明其具有抗疲劳作用[2]。但目前尚未有对牡蛎的抗疲劳能力的强化的研究。本文以营养价值较高的牡蛎作为载体,添加具有抗疲劳功效的物质,在补充各种营养的同时又能有效地提高牡蛎产品的抗疲劳作用。

选择添加物质的原则要符合“天然无毒害作用”以及“抗疲劳功效强”特点。作为卫生部公布的可用于保健食品的物品的刺五加,具有益气健脾,补肾安神的功效[7]。有大量研究表明,中药刺五加含有与人参相似的多种皂甙且抗疲劳作用强于人参[8]。戎爱群等人以刺五加、黄芪等组成的复方,通过研究证明了刺五加复方具有抗疲劳作用[9]。而同样的,路子佳等人也证明了刺五加复加西洋参而成的中药保健胶囊具有抗疲劳作用[10]。因此,本研究拟采用动物蛋白水解酶对牡蛎肉蛋白进行酶解制备酶解产物,添加不同剂量的刺五加提取物,探讨刺五加对牡蛎肉蛋白酶解产物的抗疲劳强化作用,为开发高能抗疲劳产品奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

新鲜近江牡蛎肉购于广东湛江东风市场;动物蛋白水解酶(测得酶活为16×104U/g)购于广西南宁庞博生物工程有限公司;刺五加提取物(刺五加甙B+E含量为1.3%)购于陕西锦泰生物工程有限公司;肝/肌糖原测定试剂盒、乳酸(LD)测定试剂盒、尿素氮(BUN)测定试剂盒、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒和丙二醛(MDA)测定试剂盒均购于江苏南京建成生物工程研究所;6周龄左右雄性昆明小鼠120只由广西医科大学实验动物中心提供,许可证号为SCXK桂2014-0002。

UV-2102PC型紫外分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司;HH.S11-8型水浴锅上海博讯实业有限公司医疗设备厂;CR22G型高速冷冻离心机日本日立公司;Alphal-4型冷冻干燥机德国Christ公司;BL-620S型精密电子天平日本岛津公司。

1.2实验方法

1.2.1牡蛎酶解物干粉的制备取新鲜牡蛎肉,洗净、沥干、匀浆,按1∶3料水比加入蒸馏水,调至pH7.0,加入动物蛋白水解酶量为1000 U/g肉,于53 ℃恒温水浴锅中放置6 h,取出后在1500 r/min条件下离心20 min,取上清液,冷冻干燥成干粉保存[11]。

1.2.2实验动物分组灌胃刺五加提取物的剂量参考徐峰对刺五加提取物的抗疲劳研究设定,选择0.7 g/(kg·d)作为中剂量组。参考张部昌对受试物剂量的设定,将与牡蛎蛋白酶解物复合的低剂量刺五加、中剂量刺五加和高剂量刺五加的剂量设定比例为1∶5∶15[12]。

将昆明小白鼠随机分为以下6组并进行灌胃处理。其中,阴性对照组灌胃蒸馏水、牡蛎蛋白酶解物组以1.3 g/(kg·d)进行灌胃、低剂量刺五加提取物与牡蛎蛋白酶解物复合组(LA+牡蛎蛋白酶解物组)以(0.14 g刺五加提取物+1.3 g牡蛎干粉)/(kg·d)进行灌胃、中剂量刺五加提取物与牡蛎蛋白酶解物复合组(MA+牡蛎蛋白酶解物组)以(0.7 g刺五加提取物+1.3 g牡蛎干粉)/(kg·d)进行灌胃、高剂量刺五加提取物与牡蛎蛋白酶解物复合组(HA+牡蛎蛋白酶解物组)以(2.1 g刺五加提取物+1.3 g牡蛎干粉)/(kg·d)进行灌胃、刺五加提取组以0.7 g刺五加提取物/(kg·d)进行灌胃。每只小鼠灌胃体积量为0.01 mL/g,每日上午10点左右灌胃,连续给予受试物4周,实验期间小鼠自由摄取水和食物。

1.2.3游泳实验疲劳的最主要表现是运动耐力的下降,运动耐力是反映机体疲劳最直接、最客观的指标。关于运动耐力的测定方法有运动跑台、爬杆和游泳。其中,游泳实验装置简单,且实验结果能客观地反映机体的体能。测定小鼠的力竭游泳时间是可以直接反映小鼠的抗疲劳能力的运动指标。

参考何来英等人建立的评价保健食品抗疲劳作用的实验方法,采用负重游泳的方法进行实验。经口连续给予受试物4周,于末次给样30 min后,在小鼠尾根部负小鼠体重5%的铅皮,放入水温为25 ℃的水箱中,自小鼠入水时开始计时,至小鼠力竭头部沉入水中5 s未能浮出水面时结束计时,该时间为小鼠的力竭游泳时间[13]。

1.2.4肝糖原含量的测定体内能源主要包括血糖、糖原、磷酸肌酸(CP)和三磷酸腺苷(ATP)等高能磷酸物,长时间剧烈运动时,伴随着血糖浓度降低,肌糖原、肝糖原以及血液游离脂肪酸逐步被分解利用,当血糖浓度不能维持运动需要时,疲劳就会发生。肝糖原作为能源储备物质,其含量是抗疲劳的一项生化指标[12]。

与1.2.3使用同期不同批小鼠,于末次给样30 min后,将小鼠放入水温为30 ℃的水箱中强制不负重游泳90 min后,将小鼠取出后处死取肝。按照肌/肝糖原试剂盒说明书测定肝糖原的含量。小鼠在水箱游泳期间,应避免小鼠间相互踩踏,造成呛水现象[13]。

表1　灌胃期间不同组间小鼠体重的变化Table 1　The change of mice weight during the period of intragastric administration

1.2.5血清尿素氮的测定血清尿素氮是在机体氧化供能不足的时候,蛋白质与氨基酸分解代谢的产物,随着运动负荷的增加而增加。机体内蛋白质氧化供能程度越高,血清尿素氮含量就越高,机体对运动适应性越差,越容易疲劳。

与1.2.4使用同一批小鼠,于末次给样30 min后,将小鼠放入水温为30 ℃的水箱中强制不负重游泳90 min后,将小鼠取出,用纱布擦干其眼睛周围的水,用眼科手术镊拔眼球取血约0.5 mL。将取出的血放入4 ℃环境,避免剧烈晃动,过夜取血清,按照血清尿素氮试剂盒说明书测定血清尿素氮的含量[13]。

1.2.6血乳酸的测定乳酸是机体在缺氧的情况下,糖酵解的产物,肌肉中pH下降。乳酸在体内的累积能够导致机体疲劳。乳酸的产生或者加快乳酸的消除,都可以延缓疲劳的产生或者加速疲劳的消除。因此,血乳酸水平可以反映有氧代谢能力、疲劳的产生和消除速度[14]。

与1.2.5取一批血样,取部分新鲜血样加入抗凝剂混匀。按照血乳酸试剂盒说明书测定血乳酸的含量[13]。

1.2.7阳性标准的判定与阴性对照组相比,游泳时间、肝糖原含量增加则为阳性,血清尿素氮、血乳酸减少则为阳性。反之则为阴性[13]。

2　结果与分析

2.1不同处理组对小鼠体重变化的影响

对不同处理组的小鼠进行给药灌胃4周处理,分别在灌胃后的第0、7、14、21和28 d称量小鼠体重,实验结果如表1所示。由表1可知,在4周的灌胃期间内,所有小组的小鼠体重均以正常的速度进行自然增长,而且,不同组别的小鼠体重并没有出现显著性差异。

2.2不同处理组对小鼠体内抗疲劳指标的影响

2.2.1不同处理组对小鼠力竭游泳时间的影响不同处理组对小鼠力竭游泳时间的影响如表2所示。由表2可知,牡蛎蛋白酶解物组中小鼠的力竭游泳时间为(1205±244) s,相比阴性对照组而言,游泳时间有明显的延长(p<0.05)。在添加刺五加提取物后,发现低、中剂量的刺五加提取物与牡蛎蛋白酶解物复合组的力竭游泳时间均要长于阴性对照组(p<0.01)。表明低、中剂量刺五加提取物与牡蛎蛋白酶解物复合组及牡蛎蛋白酶解物组能够增强小鼠的耐力。而且中剂量刺五加提取物与牡蛎蛋白酶解物复合组在延长小鼠游泳时间方面效果较好。表2中刺五加提取物组也表现出较强的耐力,游泳时间较阴性对照组极显著延长(p<0.01)。这表明中剂量刺五加提取物与牡蛎蛋白酶解物复合组中刺五加成分起到了关键作用。刺五加甙与具有人参皂甙相似的适应原样作用,这种作用能增强机体对疲劳、疼痛、缺氧等有害刺激的非特异性抵抗力[16-17]。这与曲中原关于刺五加总苷抗疲劳实验研究中得到的结果一致[18]。本实验也正验证了刺五加甙对于提高机体抗疲劳的有效性。

表2　不同处理组对小鼠力竭游泳时间的影响Table 2　Effect of different treatment groups on exhausting time of mice swimming

注:*表示与阴性对照组相比,差异显著(p<0.05);**表示与阴性对照组相比,差异极显著(p<0.01);表3～表5同。

2.2.2不同处理组对小鼠肝糖原含量的影响不同处理组对小鼠肝糖原含量的影响如表3所示。由表3可知,与阴性对照组相比,实验组的储存糖原的能力均有所增加。其中,牡蛎蛋白酶解物组中小鼠的肝糖原含量为(2.68±0.40)mg/g组织,相比阴性对照组而言,体内糖原含量显著增加(p<0.05)。在添加刺五加提取物后,发现中剂量刺五加提取物与牡蛎蛋白酶解物复合组的肝糖原含量最高,相比阴性对照组含量有明显的增长(p<0.01)。由表3可知在小鼠肝糖原储存能力方面,刺五加提取物组表现并不突出,与牡蛎蛋白酶解物组相关的实验组均表现出较好的肝糖原储存能力。这可能与牡蛎中的糖原物质有关。张骞对牡蛎糖原的抗疲劳活性研究发现,牡蛎糖原能够显著增加肝糖原的储备含量,为机体提供更多的能量来达到抗疲劳的目的[2]。

表3　不同处理组对小鼠肝糖原含量的影响Table 3　Effect of different treatment groups on liver glycogen content of mice

2.2.3不同处理组对小鼠血清尿素氮含量的影响不同处理组对小鼠尿素氮含量的影响如表4所示。由表4可知,与阴性对照组相比,所有实验组中小鼠尿素氮含量均有降低。其中,牡蛎蛋白酶解物组中小鼠尿素氮含量为(12.16±1.04) mmol/L,与阴性对照组并无显著性差异。在添加刺五加提取物后,发现中、高剂量刺五加提取物与牡蛎蛋白酶解物复合组的尿素氮含量均极显著降低(p<0.01),分别为(10.76±1.57) mmol/L和(10.40±1.29) mmol/L。刺五加提取物组的尿素氮含量为(11.09±1.21) mmol/L,相比阴性对照组也有显著降低现象(p<0.05)。这与曲中原对刺五加总苷抗疲劳实验研究中,得到的小鼠游泳后血清尿素氮含量结果趋势一致[18]。也有研究发现,刺五加中富含的天然生物活性物质可以抑制机体肾上腺皮质酮分泌,减缓蛋白质的分解,从而达到抵抗疲劳的目的[19]。

表4　不同处理组对小鼠血清尿素氮含量的影响Table 4　Effect of different treatment groups on serum urea nitrogen content of mice

2.2.4不同处理组对小鼠乳酸含量的影响由表5中的血乳酸含量可知,不负重游泳90 min后,牡蛎蛋白酶解物组体内乳酸水平为(16.86±1.15) mmol/L,相比阴性对照组相比极显著降低(p<0.01)。而刺五加提取物体内乳酸水平为(18.34±0.59) mmol/L,与阴性对照组并无显著性差异。在添加刺五加提取物后,低、中剂量刺五加提取物与牡蛎蛋白酶解物复合组与阴性对照组相比具有极显著性差异(p<0.01),而与牡蛎蛋白酶解物组相比不具有显著性差异。王勇通过研究牡蛎提取液对小鼠运动耐力及骨骼肌自由基、能量代谢酶的影响发现,牡蛎提取液能够显著提高小鼠骨骼肌组织中的乳酸脱氢酶(LDH)活性(p<0.05)[20]。LDH是乳酸功能系统中的一种重要酶,它能催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应[21]。因此可以判断在抑制或消除乳酸水平能力上,牡蛎蛋白酶解物起关键作用。

表5　不同处理组对小鼠乳酸含量的影响Table 5　Effect of different treatment groups on blood lactic acid content of mice

3　结论

通过测定小鼠的力竭游泳时间、肝糖原含量、血清尿素氮(BUN)含量和乳酸(LD)含量四个指标来评价刺五加提取物强化牡蛎蛋白酶解物抗疲劳的效果。牡蛎蛋白酶解物组的一项运动指标(即小鼠力竭游泳时间)显示阳性且p<0.05,两项生化指标(即肝糖原含量和血乳酸含量)均为阳性且显著性分别为p<0.01和p<0.05,这表明牡蛎蛋白酶解物组具有抗疲劳效果。而在牡蛎蛋白酶解物中添加刺五加提取物之后,中剂量的刺五加提取物(0.70 g/kg)表现出更好的抗疲劳效果,一项运动指标(即小鼠力竭游泳时间)以及三项生化指标(肝糖原含量、血清尿素氮含量和血乳酸含量)均显示阳性且显著性均为p<0.01。由此可以判断,添加中剂量的刺五加提取物(0.70 g/kg)确实能够强化牡蛎蛋白酶解物的抗疲劳效果。

而添加低剂量(0.14 g/kg)和高剂量的刺五加提取物(2.10 g/kg)两组的抗疲劳效果并没有比牡蛎蛋白酶解物组好。因此添加刺五加提取物而增强牡蛎蛋白酶解物抗疲劳效果,并不是刺五加成分和牡蛎酶解物成分抗疲劳效果的简单加乘作用,有可能是刺五加与牡蛎中的成分相互协同作用的最终结果。

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Effect ofAcanthopanaxextracts strengthen the anti-fatigue ability of hydrolysates from oyster

CHANG Ge,QIN Xiao-ming*,ZHANG Chao-hua,CHEN Jian-ping

(Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety,Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing(Zhanjiang),College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China)

This study was to addAcanthopanaxextracts into protein hydrolysates from oyster to strengthen the anti-fatigue ability of protein hydrolysates from oyster,when it could be estimated by exhaustive swimming in mice. These experimental mice were randomly divided into six groups:negative control group,protein hydrolysates from oyster group(HO,for short),low-doseAcanthopanaxextracts(0.14 g/kg)combined with protein hydrolysates from oyster(LA+HO,for short)group,middle-doseAcanthopanaxextracts(0.70 g/kg)combined with protein hydrolysates from oyster(MA+HO,for short)group,high-doseAcanthopanaxextracts(2.10 g/kg)combined with protein hydrolysates from oyster(HA+HO,for short)group andAcanthopanaxextracts group. Then,drugs were chronically administered to the mice for 4 weeks. To confirm the anti-fatigue effect of these groups,the exhausting time of mice swimming,liver glycogen content,serum urea nitrogen content and blood lactic acid content of mice were measured. The results showed that two biochemical indexes and one sport index of HO were positive,indicated that HO was antti-fatigue. While addAcanthopanaxextracts into HO,three biochemical indexes and one sport index of MA+HO were positive,it showed that MA+HO had the stronger ability of anti-fatigue. It concluded that middle-doseAcanthopanaxextracts could improve the anti-fatigue activity of protein hydrolysates from oyster,and the results would highly benefit the research and development of effective anti-fatigue healthy foods in the near future.

protein hydrolysates from oyster;Acanthopanaxextract;exhaustive swimming in mice;anti-fatigue ability

2016-01-25

常格(1990-)，女，在读硕士研究生，主要从事水产品高值化利用方面的研究，E-mail：13058383213@163.com。

秦小明(1964-)，男，博士，教授，主要从事海洋生物资源高值化利用方面的研究，E-mail：xiaoming0502@21cn.com。

现代农业技术体系建设专项资金资助(CARS-48-07B)；广东省科技厅(2010B020201014)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)14-0334-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.058