肠道微生物体外发酵模型研究进展及其在食品中的应用

支梓鉴,俞邱豪,程　焕,陈健乐,叶兴乾,陈士国

(浙江大学,生物系统工程与食品科学学院,馥莉食品研究院,浙江省农产品加工技术研究重点实验室,浙江杭州 310058)



肠道微生物体外发酵模型研究进展及其在食品中的应用

支梓鉴,俞邱豪,程焕,陈健乐,叶兴乾,陈士国*

(浙江大学,生物系统工程与食品科学学院,馥莉食品研究院,浙江省农产品加工技术研究重点实验室,浙江杭州 310058)

随着分子微生态学,特别是高通量测序技术的快速发展,人们对肠道微生物的作用有了进一步认识。肠道不仅是消化吸收的场所,其微生物菌群现更被认为是一个高度特异化的“器官”,其代谢活力直接影响人体的健康。但直接对人体或动物模型肠道内容物取样进行研究,操作复杂且有悖道德伦理,因此近来体外肠道发酵模型成为研究热点,为此类研究提供了一个新的可行性途径。本文综述了体外发酵模型的研究进展及其在食品功能研究中的部分应用,并结合相关高通量检测技术发展提出展望,以期为肠道微生物或食品代谢等相关研究提供一定的参考依据。

肠道微生物,体外发酵模型,高通量测序

人体肠道菌群是高度复杂多样性的微生物菌落,其数量众多、种类丰富,广泛参与人体多种生理活动,对人体健康起着至关重要的作用[1-4]。正常成年人肠道微生物主要包括厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门、梭杆菌门和疣微菌门[5],其中,拟杆菌门和梭杆菌门参与分解代谢产生乙酸、丙酸和丁酸盐,抑制炎症和结肠癌;双歧杆菌、乳酸杆菌可合成部分维生素,促进肠道蠕动,抑制致病菌生长;真杆菌和一些梭菌代谢产生次级胆酸,提高胆固醇含量,具有诱变和致癌作用[6]。同时,近些年研究表明,人体肠道不仅负责食物加工,而且其微生物菌群与心情、免疫、肥胖、糖尿病、大肠癌、心脑血管疾病等有着密切关系[3-4,7]。

目前,肠道微生物生物组成和多样性评价主要集中于利用宏基因组学等方法检测粪便样品,但这仅代表了远端大肠的菌群特征。然而这些研究并未提供深入探讨动态微生物进程和肠道特定位置功能或消化性能的信息。体外发酵模型从简单的厌氧环境中粪便微生物的批量发酵到复杂的一级或多级连续发酵模型,为其逐步演变为科学研究提供了更多可能。体外发酵模型是研究大量底物筛选的有效工具,其中包括膳食组分、药物和有毒或放射性组分,同时也可对肠道微生物环境的变化进行测定。模型的主要目的是在可控条件下培育复杂肠道微生物菌群,用于微生物调控和代谢的相关研究。目前,有关体外发酵模型和肠道微生物的相关研究已成为食品领域的新热点,但还比较薄弱,需要进一步深入研究。本文就国内外目前经典的体外肠道模型及其发展和应用进行综述,旨在加快该领域的发展。

表1　体外发酵模型特定及其局限性Table 1　The characteristics and limitations of in vitro fermentation models

1　体外发酵模型

从单一发酵罐到多相连续发酵系统,体外发酵模型的设计和复杂性随着接种技术的发展而不断升级[8-11]。模型均需特定的时间使完整的微生物菌群处于稳定状态,因此需根据研究目标进行不同的选择,其中,模型种类、特点及其局限性如表1所示。

1.1批式发酵模型

批式发酵是单一或混合细菌悬浮液在特定选择培养液中进行发酵,期间不再添加新的营养物,且模型一般为密封瓶子或反应器,保证其厌氧环境。此模型具有简单、易操作和价格低廉等优点。然而,在实验过程中,微生物发酵会导致短链脂肪酸产生并积累,从而造成发酵系统中pH的改变,影响发酵正常进行。系统中微生物的生长主要依靠接种浓度和底物消耗速率控制。低细胞浓度接种的系统呈现出典型的S-型生长曲线,发酵前期存在丰富营养物,随后营养物被消耗,同时产生有毒代谢产物积累,生长受到抑制。微生物菌群的评价和微生物代谢调控等复杂性实验需要连续性的底物补给,否则,发酵时间会大大缩短，从而抑制体外稳定条件的形成。因此,此模型仅适用于短期发酵的相关研究,以及底物对肠道微生物生理和生物多样性的影响。如抗性淀粉和果聚糖等碳水化合物是否具有益生元潜力[12-13],以及食物组分被肠道微生物作用时短链脂肪酸短期代谢情况研究[14]。

1.2连续发酵模型

连续发酵模型克服了批式发酵模型的一些弱点,通过连续补充营养底物,同时转移有毒代谢产物,达到延长微生物发酵时间的目的。连续发酵模型分为单相和多相连续发酵模型,其中,单相发酵模型能够较好模拟盲肠和升结肠的消化情况,因此常被用于阐明近端结肠功能和代谢活力[9]。

然而,人体肠道环境是一个多相环境,分为升结肠、横结肠和降结肠三个区域,每个区域在代谢活力和微生物组成上均存在差异。因此,多相连续发酵模型设置不同反应器模拟肠道不同阶段,能更准确模拟肠道生态环境。Macfarlane等[15]开发出三相发酵模型,如图1所示,图中Vessel 1、Vessel 2和Vessel 3三个恒化器串联模拟近端、横向、远端结肠区域,其体积分别为0.22、0.32和0.32 L,pH分别为5.5、6.6和6.8,系统温度维持在37 ℃,且充入CO2保持厌氧环境。整体系统参数按照人体生理情况进行设定,实现发酵在空间、时间、营养和理化特性上的准确性和合理性。此外,微生物接种液转移至发酵模型过程中的适应、生长和增殖均要依靠环境参数,如pH、保留时间、温度、厌氧环境和介质流速,因此实验过程中严格控制参数是构建微生物组成和代谢活力稳态的关键。

图1　三相发酵模型示意图Fig.1　Schematic diagram of the three-stage fermentation model

图2　五相发酵模型示意图Fig.2　Schematic diagram of the five-stage fermentation model

1993年,Molly等[16]开发SHIME(The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem)模型。它是一个五相发酵模型,包含五部分组件,分别模拟了食物经过上消化道(胃部、小肠)和下消化道(升结肠、横结肠和降结肠)整个过程。整个SHIME反应器应在37 ℃进行工作,反应器均为双层夹套的玻璃容器,且通过磁力搅拌进行混合溶液。研究人员需每天添加3次营养液至胃室,胰液和胆汁至小肠室。在胃和小肠室内消化的基础上,悬浮液在泵作用下抽入升结肠容器进行结肠消化。消化液在反应器中的保留时间可根据研究目的通过改变流速进行调整,胃室、小肠室、升结肠室、横结肠室、降结肠室反应体积分别为0.2、0.3、0.7、1.3、0.8 L,保留时间分别为2、6、18、36、22 h,pH分别为2、6.8、5.6～5.9、6.1～6.4和6.6～6.9。同时,整个模型通过顶端空间充入氮气或N2/CO2(9∶1)来维持厌氧环境。

粘膜微生物是肠道微生物生态系统的重要组成部分,它与腔内微生物在菌群组成上存在本质区别,且定居于肠道上皮细胞的粘液,因此,粘膜微生物对调节肠道健康有更高效能[17]。Abbeele等发现柔嫩梭菌(aecalibacterium prausnitzii)的存在能够抑制克罗恩病的发生[17]和术后复发[18]。随后,Abbeele等[19]通过黏蛋白覆盖微生物群来模拟粘膜微生物群落,梭状芽孢杆菌IV和XIVa产生大量丁酸并转运至结肠细胞,加强细胞间连,提高肠道屏障功能。同时,研究表明,M-SHIME模型能够维持个体微生物群落中粘膜微生物组成特有属性。

此外,为解决发酵过程中系统游离细胞不易控制等问题,细胞固定化技术与连续发酵联用以期达到持久发酵等目的,其中,应用最为广泛固定化技术的是多孔糖基质固定化。固定化细胞转移至营养生长液后,受到底物和产物扩散的限制,能够在糖基质上形成高细胞密度层(1010～5×1011),随后细胞释放在培养液中,并维持高细胞活力。研究发现[20],细胞固定化发酵过程中,乳酸菌和双歧杆菌数量明显优于传统游离细胞发酵,同时,可防止长期连续发酵时冲洗现象,减少污染敏感性和噬菌体攻击,增强质粒稳定性,防止细胞受到磁力搅拌剪切力影响。因此,Cinquin等[11]利用固定化的粪便微生物模拟肠道发酵,固定化复合粪便微生物模型能快速达到系统平衡,维持高细胞密度,并能利用预固定化基质进行多参数实验,同时可通过修饰细菌生理参数改善肠道模型。

1.3自动化发酵模型

随着科技的快速发展,计算机控制系统推动了发酵模型的进一步发展。Minekus等[21]开发出一项新型电脑控制的肠道发酵模型——TIM-2模型，如图3所示。发酵装置主要由四部分相互连接的玻璃腔室(a)组成,每个腔室内部均有一个弹性薄膜。在玻璃夹套和弹性膜之间泵入37 ℃水维持恒温环境,通过改变泵入水压造成弹性膜压缩或舒张来模拟肠道蠕动,同时形成蠕动波推动食糜内容物在环形体系中移动。TIM-2模型系统pH由pH电极(b)在线监测,并通过添加1 mol/L NaOH(c)中和微生物产生的酸性物质控制pH恒定在5.8左右。为防止代谢产物累积造成微生物菌群生长抑制或死亡,系统配备一个由中空纤维膜构成的透析系统(d),它能够截留50000 u的分子,稳定模型中微生物代谢产物的生理浓度,如短链脂肪酸生理浓度为80～120 mmol/L,从而维持系统3周的微生物活力。随着透析液和食物的摄入和增加,系统体积不断增加,当达到一定体积后,水平检测器(e)激活排出阀,维持内容物体积在120 mL左右的水平。此外,系统持续吹入氮气(f)保证厌氧环境,加之微生物活力,使得系统氧化还原电位稳定在300 mV左右。实验过程中,可通过取样口(g)或回收透析液(d)进行取样。该模型的优点是存在蠕动和透析系统以维持代谢产物的生理浓度和正常浓度下的高微生物活性,同时,可改变单参数研究对微生物代谢活力的影响。但TIM-2模型仅动态模拟了大肠发酵的环境,为了达到更好的模拟效果,该模型可与TIM-1模型连用,模拟整个人体消化道生理环境。

图3　TIM-2示意图Fig.3 Schematic diagram of TIM-2 注:(a)蠕动室；(b)pH电极；(c)碱液泵；(d)含有中空纤维膜的透析液回路；(e)水平检测器；(f)N2入口；(g)取样口；(h)气体出口；(i)回肠流出液集中室；(j)温度检测器。

SIMGI(SIMulator Gastro-Intestinal)也是一个体外自动化发酵模型,通过内置编程软件的操作板控制动态模拟从胃、小肠消化到大肠发酵、生物代谢转换等完整生理过程[22]。其中,升结肠、横结肠和降结肠pH分别为5.6±0.2、6.3±0.2和6.8±0.2,体积分别为250、400和300 mL。发酵营养液包含阿拉伯半乳聚糖(1 g/L)、苹果果胶(2 g/L)、木聚糖(1 g/L)、土豆淀粉(3 g/L)、葡萄糖(0.4 g/L)、酵母提取物(3 g/L)、蛋白胨(1 g/L)、黏蛋白(4 g/L)、L-半胱氨酸(0.5 g/L)。该模型的主要优点是灵活性的组件和自控化控制参数模拟生理条件,同时具有胃和小肠排空功能,但模型需14 d的稳定周期后才能进行实验,实验周期较长。同样,模型缺少肠道菌群与宿主间的相互作用,可尝试将上皮细胞和免疫细胞共培养模拟肠道生理环境。

图4　SIMGI模型示意图Fig.4　Schematic diagram of the SIMGI

2　体外消化模型在食品中的应用

2.1食品组分对肠道微生物菌群变化的研究

人体肠道菌群种类复杂、数量丰富,高达1013～1014,超过人体细胞总数10倍,所编码的基因是人类基因组的150倍以上[1-2]。肠道微生物与其代谢产物在人体能量代谢、营养物质吸收、先天和获得性免疫、胃肠道功能等方面发挥主要作用[23]。此外,肠道微生物菌群的组成易受年龄、体重、性别、饮食[24]等因素影响,因而不同人群的肠道菌群表现出个体差异性。Kemperman等[25]利用SHIME模型研究了红茶和葡萄酒中酚类物质对肠道微生物的影响,研究发现,两种酚类提取物均可选择性抑制肠道致病菌,且能够使厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)比例发生变化。红茶酚类提取物刺激克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠球菌(Enterococci)和Akkermansia生长,抑制双歧杆菌(Bifidobacteria)、B.coccoides、Anaeroglobus、食物谷菌属的生长;葡萄酒中酚类物质能够促进克雷伯氏菌属(Klebsiella)、Alistipes、Cloacibacillus和Victivallis的生长,减少双歧杆菌(Bifidobacteria)、B.coccoides、Anaeroglobus、Subdoligranulum和拟杆菌门(Bacteroidetes)的数量。但Parker等[26]则认为对肠道微生物起调节作用的是酚类物质的代谢物,而非多酚本身。Abbeele等[27]利用SHIME模型和TIM-2模型研究长链阿拉伯木聚糖和菊粉的发酵方式的区别,实验证明,长链阿拉伯木聚糖和菊粉能够分别增加丙酸和丁酸代谢产物的含量,阿拉伯木聚糖促进长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)生长,而菊粉选择性促进青春双歧杆菌生长。此外,Kortman等[28]研究了利用体外模型铁补充剂对肠道微生物代谢的影响,研究表明,铁离子的补充会造成双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)和乳酸菌科(Lactobacillaceae)水平降低,罗斯氏菌属(Roseburia)和普雷沃菌属(Prevotella)水平升高,代谢产生的支链脂肪酸和氨的含量显著增加,同时,在富含铁条件下,其代谢液对Caco-2细胞毒性增加。

2.2肠道微生物对功能因子代谢酵解研究

膳食中的功能多糖和多酚类物质等在进入肠道后,易受到肠道微生物作用而发生一定的代谢降解,进而发挥生理功能。Hu等[29]利用体外发酵模型研究车前子多糖在大肠酵解中的变化,结果表明,以乙酸、丙酸和正丁酸为主要组成成分的短链脂肪酸总量随酵解时间的增加而增加,其中,乙酸和正丁酸的增加主要是由于车前子多糖中葡萄糖醛酸和木糖的酵解,而丙酸的增加主要是由于多糖中阿拉伯糖和木糖的酵解。同样,Min等[30]发现青钱柳叶多糖在体外模型酵解过程中短链脂肪酸含量增加,多糖被部分酵解,与半乳糖醛酸相连的糖苷键更容易被肠道微生物攻击。Gonthier等[31]利用批量发酵模型研究绿原酸的降解路径,绿原酸的酯键在肠道微生物作用下发生水解,并通过脱羧反应、双键还原反应或去羟基化反应转化为乙基儿茶素或3-羟基苯甲酸,后经β-氧化形成苯甲酸。

3　展望

3.1体外肠道发酵模型的接种和重现性

尽管存在多种体外发酵模型的组合设计,但仍然存在许多挑战和局限制约着这项技术的发展。体外模型中肠道微生物的重现性和功能稳定性频受质疑,模型稳定性主要依据实验因素对微生物组分和代谢活力的影响,而并非肠道微生物对模拟肠道环境的适应能力。在环境因素和初始菌种多样性等条件下,系统在接种和增殖后肠道微生物会形成新的平衡。近几年研究发现,利用肠芯片技术检测TIM-2和SHIME模型中微生物分布,细菌比例会产生明显差异[8,32]。严格、可重复性的粪便收集过程在发酵过程中起着至关重要的作用,其能够保证接种液新鲜度,并决定其在肠道中的增殖速率。模型中菌种还受到连续取样等因素影响而发生不断变化,也易造成生物重现性差等现象。因此,开发出在线可控肠道微生物模型,严格准确监控模型参数至关重要。

3.2功能稳定的体外肠道发酵模型的“组学”分析

蛋白质谱测序技术已成功发掘了肠道菌群发酵过程(体内及原位)中复杂的交互作用及其代谢的主要途径,但是对体外菌群的发酵机制的研究仍不清楚[33-35]。目前,“组学”技术在体外发酵模型中的应用仅局限于利用微阵列技术或SIP技术进行系统发生分析[8,32,36]。SIP技术应用于微生物代谢中,用13C标记底物追踪菌群代谢中某一物质的路径[37-38]。宏基因组学研究技术在各种实验条件下对特定的人体肠道菌群潜在的基因进行分类,表明组学技术可用于研究人体肠道菌群[39-40]。尽管宏基因组分析技术能够提供菌群潜在的基因,但并不代表具有此类基因的菌群具有相应的功能。环境转录组学在环境微生物生态学方面的研究进展提高了识别基因表达所引起功能变化的能力[34,41]。然而,由于翻译后调控等机制的存在,环境转录组学所研究出来的结果并不能明确的说明mRNA丰度与其转录出的蛋白活性有直接的关系。从复杂的生物样品中提取、分离、纯化和鉴定蛋白质等方法上的缺陷仍阻碍着人类肠道菌群功能相关的蛋白组学的进一步发展[42]。代谢和细胞内的生化过程产生大量的代谢产物,并被分配给肠道内特定菌群供其发挥功能,这可能由代谢组学技术来阐明此类研究[43-44]。人体肠道微生物作用下的酚类代谢研究就是利用蛋白质测序技术识别菌群和代谢间交互作用的重要例子。同时,鉴于荟萃分析技术的研究进展,生物信息学领域面临的最大挑战可能在于建立完善的基因数据库,发明更快、更简单的分析方法用以分析来自于高通量测序和代谢组学分析肠道微生物相关信息所产生的大量数据。

3.3体外模型的应用展望

阐明人类肠道菌群在体外模型中的调控机制和代谢概况需要“组学”为基础的检测技术。多学科系统研究法结合“组学”技术将促成新的研究系统去推动复杂微生物和宿主因素对人类肠道微生物功能性相关研究。体外肠道发酵模型无法有效模拟宿主响应是目前面临的主要技术难题,但宿主应答可通过体外酵解模型和体外小肠细胞模型结合来实现,如Caco-2细胞[45]。未来体外发酵模型系统还应涉及“患病者”微生物群的建立和稳态,使其便于进行炎性肠疾病中肠道微生物功能性的研究,如克罗恩疾病和溃疡性结肠炎,且目前这些疾病病理学研究主要集中在复杂的免疫系统功能[46]。基于体外模型的不断发展,也可促进免疫系统之外疾病的相关研究,同时关于肠道微生物的研究为“人体肠道系统生物学”方法提供了新的契机。

4　结论

体外发酵模型是一种创新技术平台,其最大优点能够表现出优良的实验性能,同时不受人类道德约束。但大量体外发酵模型仅模拟了宿主部分肠功能,且微生物菌群平衡仍然是面临的一个重大挑战。然而,在实验中宿主机能不能被完全忽略,因此可结合人体肠道细胞提供宿主应答等信息,为体外研究提供更加准确的结果。鉴于更准确实现体内研究结果,必须结合体外和体内模型进行结果互补,这样不仅能加强体外模型的整体有效性,同时可区分肠道微生物与人体间的功能关系。目前,我国学者在体外肠道模拟研究肠道菌群结构和功能领域的研究相对较少,归根到底是模型建立存在一定问题,因此,进一步完善和开发体外肠道模型,在线精确控制进程参数等工作亟需加强。此外,利用体外模型相关实验,不能仅停留在表观微生物改变和代谢产物的变化,梳理酵解过程中食品成分结构变化及相关机理才是未来发现的新方向。

[1]Qin J,Li R,Raes J,et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing[J]. Nature,2010,464(7285):59-65.

[2]Gill S R,Pop M,DeBoy R T,et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome[J]. Science,2006,312(5778):1355-1359.

[3]Sekirov I,Russell S L,Antunes L C M,et al. Gut microbiota in health and disease[J]. Physiological Reviews,2010,90(3):859-904.

[4]Clemente J C,Ursell L K,Parfrey L W,et al. The impact of the gut microbiota on human health:An integrative view[J]. Cell,2012,148:1258-1270.

[5]Eckburg P B,Bik E M,Bernstein C N,et al. Diversity of the human intestinal microbial flora[J]. Science,2005,308:1635-1638.

[6]Van Hylckama Vlieg J ET,Veiga P,Zhang C,et al. Impact of microbial transformation of food on health-from fermented foods to fermentation in the gastro-intestinal tract[J]. Current Opinion in Biotechnology,2011,22：211-219.

[7]Round J L,Mazmanian S K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease[J]. Nature Reviews Immunology,2009,9(5):313-323.

[8]Van den Abbeele P,Grootaert C,Marzorati M,et al. Microbial community development in a dynamic gut model is reproducible,colon region specific,and selective for bacteroidetes and clostridium cluster IX[J]. Applied and Environmental Microbiology,2010,76(15):5237-5246.

[9]Macfarlane G T M A. Models for intestinal fermentation:association between food components,delivery systems,bioavailability and functional interactions in the gut[J]. Current Opinion in Biotechnology,2007(18):156-162.

[10]Cinquin C,Le Blay G,Fliss I,et al. New three-stageinvitromodel for infant colonic fermentation with immobilized fecal microbiota[J]. FEMS Microbiol Ecol,2006,57(2):324-336.

[11]Cinquin C,Le Blay G,Fliss I,et al. Immobilization of infant fecal microbiota and utilization in aninvitrocolonic fermentation Model[J]. Microbial Ecology,2004,48(1):128-138.

[12]Lesmes U,Beards E J,Gibson G R,et al. Effects of resistant starch type III polymorphs on human colon microbiota and short chain fatty acids in human gut models[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56(13):5415-5421.

[13]Pompei A,Cordisco L,Raimondi S,et al.Invitrocomparison of the prebiotic effects of two inulin-type fructans[J]. Anaerobe,2008,14(5):280-286.

[14]Gumienna M,Lasik M,Czarnecki Z. Bioconversion of grape and chokeberry wine polyphenols during simulated gastrointestinalinvitrodigestion[J]. International Journal of Food Sciences and Nutrition,2011,62(3):226-233.

[15]G T Macfarlane S M G R. Validation of a three-stage compound continuous culture system for investigating the effect of retention time on the ecology and metabolism of bacteria in the human colon[J]. Microbial Ecology,1998(35):180-187.

[16]Molly K,Woestyne M V,Verstraete W. Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,1993(39):254-258.

[17]Van den Abbeele P,Van de Wiele T,Werstraete W,et al. The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms:a novel concept[J]. FEMS Microbiol ReV,2011(35):681-704.

[18]Sokol H,Pigneur B,Watterlot L,et al. Faecalibacterium prausnitzii is an anti-inflammatory commensal bacterium identified by gut microbiota analysis of Crohn disease patients[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(43):16731-16736.

[19]Van den Abbeele P,Belzer C,Goossens M,et al. Butyrate-producing clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in aninvitrogut model[J]. ISME J,2013,7(5):949-961.

[20]Lacroix C,Grattepanche F,Doleyres Y,et al. Immobilised cell technologies for the dairy industry[J]. Crit Rev Biotechnol,2003(14):109-134.

[21]Minekus M,Smeets-Peeters M,Bernalier A,et al. A computer-controlled system to simulate conditions of the large intestine with peristaltic mixing,water absorption and absorption of fermentation products[J]. Appl Microbiol Biotechnol,1999,53(1):108-114.

[22]Barroso E,Cueva C,Peláez C,et al. Development of human colonic microbiota in the computer-controlled dynamic simulator of the gastroIntestinal tract SIMGI[J]. LWT-Food Science and Technology,2015,61(2):283-289.

[23]王子恺,杨云生. 肠道微生物与人类疾病[J]. 解放军医学杂志,2012,37(12):1168-1176.

[24]David L A,Maurice C F,Carmody R N,et al. Diet rapidly and reproducibly alters the human gut microbiome[J]. Nature,2013,505(7484):559-563.

[25]Kemperman R A,Gross G,Mondot S,et al. Impact of polyphenols from black tea and red wine/grape juice on a gut model microbiome[J]. Food Research International,2013,53(2):659-669.

[26]Parkar S G,Stevenson D E,Skinner M A. The potential influence of fruit polyphenols on colonic microflora and human gut health[J]. International Journal of Food Microbiology,2008,124(3):295-298.

[27]Van den Abbeele P,Venema K,Van de Wiele T,et al. Different human gut models reveal the distinct fermentation patterns of arabinoxylan versus inulin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2013,61(41):9819-9827.

[28]Kortaman G A M,Dutilh B E,Maathuis A J H,et al. Microbial Metabolism Shifts Towards an Adverse Profile with Supplementary Iron in the TIM-2InvitroModel of the Human Colon[J]. Frontiers in Microbiology,2015,6:1-17.

[29]Hu J,Nie S,Li C,et al.Invitrofermentation of polysaccharide from the seeds ofPlantagoasiaticaL. by human fecal microbiota[J]. Food Hydrocolloids,2013(33):384-392.

[30]Min F,Hu J,Nie S,et al.Invitrofermentation of the polysaccharides from Cyclocarya paliurus leaves by human fecal inoculums[J]. Carbohydrate Polymers,2014(112):563-568.

[31]Gonthier M P,Remesy C,Scalbert A,et al. Microbial metabolism of caffeic acid and its esters chlorogenic and caftaric acids by human faecal microbiotainvitro[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy,2006,60(9):536-540.

[32]Rajilic-Stojanovic M,Maathuis A,Heilig H G H J,et al. Evaluating the microbial diversity of aninvitromodel of the human large intestine by phylogenetic microarray analysis[J]. Microbiology,2010,156(11):3270-3281.

[33]Waldram A,Holmes E,Wang Y,et al. Top-down systems biology modeling of host metabotype-microbiome associations in obese rodents[J]. Journal of Proteome Research,2009,8(5):2361-2375.

[34]Urich T,Lanzen A,Qi J. Simultaneous assessment of soil microbial community structure and function through analysis of the meta-transcriptome[J]. PLos One,2008(3):e2527.

[35]Van Duynhoven J,Vaughan E E,Jacobs D M,et al. Metabolic fate of polyphenols in the human superorganism[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,2011,108(S1):4531-4538.

[36]Kovatcheva-Datchary P,Egert M,Maathuis A,et al. Linking phylogenetic identities of bacteria to starch fermentation in aninvitromodel of the large intestine by RNA-based stable isotope probing[J]. Environmental Microbiology,2009,11(4):914-926.

[37]Neufeld J D,Wagner M,Murrell J C. Who eats what,where and when Isotope-labelling experiments are coming of age[J]. ISME J,2007,1(2):103-110.

[38]de Graaf A A,Maathuis A,de Waard P,et al. Profiling human gut bacterial metabolism and its kinetics using[U-13C]glucose and NMR[J]. NMR in Biomedicine,2010,23(1):2-12.

[39]Egert M,de Graaf A A,Smidt H,et al. Beyond diversity:functional microbiomics of the human colon[J]. Trends in Microbiology,2006,14(2):86-91.

[40]Backhed F. Host-bacterial mutualism in the human intestine[J]. Science,2005,307(5717):1915-1920.

[41]Frias-Lopez J,Shi Y,Tyson G W,et al. Microbial community gene expression in ocean surface waters[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(10):3805-3810.

[42]Rooijers K,Kolmeder C,Juste C,et al. An iterative workflow for mining the human intestinal metaproteome[J]. BMC Genomics,2011(12):6.

[43]Turnbaugh P J,Gordon J I. An invitation to the marriage of metagenomics and metabolomics[J]. Cell,2008，134(5)：708-713.

[44]Li M,Wang B,Zhang M,et al. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(6):2117-2122.

[45]Déat E,Blanquet-Diot S,Jarrige J,et al. Combining the dynamic TNO-gastrointestinal tract system with a Caco-2 cell culture model:application to the assessment of lycopene andα-tocopherol bioavailability from a whole food[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2009,57(23):11314-11320.

[46]Schirbel A,Fiocchi C. Inflammatory bowel disease:Established and evolving considerations on its etiopathogenesis and therapy[J]. Journal of Digestive Diseases,2010,11(5):266-276.

Advances ininvitrofermentation model of gut microbiota and its applications in food

ZHI Zi-jian,YU Qiu-hao,CHENG Huan,CHEN Jian-le,YE Xing-qian,CHEN Shi-guo*

(College of Biosystems Engineering and Food Science,Fuli Institute of Food Science,Zhejiang Key Laboratory for Agro-food Processing,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

With the rapid development of molecular microbial ecology,especially high-throughput sequencing technology,people have a better understanding of gut microbial communities. Intestinal is more than a place of digestion and absorption of food component,and the gut microbiota inside is even regarded as a highly specialized organ whose metabolic activity has a direct impact on human health. However,direct sampling from human or animal model is complex and contrary to ethics. Thus,invitrogut fermentation model presents a novel system for relevant research. This paper summarized the advances ininvitrofermentation models and their applications in functional food research,and proposes the forecast combined with the high-throughput sequencing technology,aiming to provide valuable references for in-depth study on gut microorganism and the metabolism of food.

gut microbiota;invitrogut fermentation model;high-throughput sequencing technology

2016-01-06

支梓鉴(1991-)，男，硕士研究生，研究方向：食品科学，E-mail：zhizijian8866@163.com。

陈士国(1982-)，男，副教授，研究方向：糖化学和糖生物学，E-mail：chenshiguo210@163.com。

国家自然科学基金(31301417)；浙江省公益项目(2014C32G2010026)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)14-0353-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.062