重症手足口病患儿肠道菌群和肠粘膜通透性的相关研究

苏宇飞，陈　镜，王　列，文　俊

(西安市儿童医院急诊科，陕西 西安 710003)



【临床研究】

重症手足口病患儿肠道菌群和肠粘膜通透性的相关研究

苏宇飞，陈镜，王列，文俊

(西安市儿童医院急诊科，陕西 西安 710003)

目的探讨重症手足口病患儿肠道菌群和肠粘膜通透性的变化，为临床给予益生菌治疗提供参考依据。方法选取西安市儿童医院感染科2013年5月至2015年4月收治的重症手足口病患儿100例作为研究组，同时随机选取同期体检的健康儿童50例作为对照组，采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术分别检测研究组患儿疾病初期、恢复期及对照组儿童粪便中大肠杆菌及双歧杆菌的含量，同时分别采用改良基质偶氮显色法、改良邻联茴香胺试剂法、酶学分光光度计法检测血液中内毒素、二胺氧化酶(DAO)，D-乳酸水平。结果重症手足口病患儿粪便双歧杆菌含量在疾病初期对数值(8.79±0.58CFU/g)，显著低于恢复期(9.26±0.98CFU/g)和正常对照组(9.29±0.86CFU/g)，F=3.129，P=0.048，恢复期患儿与对照组儿童双歧杆菌含量差异无统计学意义(t=0.088，P=0.930)；疾病初期(9.20±0.84CFU/g)和恢复期(9.03±0.82CFU/g)大肠杆菌对数值均显著高于正常对照组(7.58±0.35CFU/g)，F=3.707，P=0.028，疾病初期及恢复期大肠杆菌含量相比，差异无统计学意义(t=0.824，P=0.413)；双歧杆菌/大肠杆菌的比值(B/E)在疾病初期(0.96±0.24)和恢复期(1.02±0.31)均显著低于对照组儿童(1.23±0.46)，F=3.254，P=0.043，疾病初期和恢复期B/E比值差别无统计学意义(t=0.877，P=0.384)；重症手足口病患儿血液中内毒素(0.53±0.10EU/mL)、DAO(0.08±0.02μmmol·min-1·mL-1)、D-乳酸(5.32±0.97μmmol/mL)与对照组儿童(0.48±0.09EU/mL、0.07±0.01μmmol·min-1·mL-1、4.96±0.90μmmol/mL)比较差异有统计学意义(t值分别为2.468、2.772、2.319，均P<0.05)。结论重症手足口病患儿肠道菌群组成发生变化，大肠杆菌含量增高，疾病初期双歧杆菌含量减少，且伴肠黏膜屏障通透性改变，临床可应用益生菌辅助治疗。

重症手足口病；肠道菌群；肠粘膜屏障；益生菌

[Abstract]Objective To investigate the changes of intestinal flora and mucosal permeability in severe hand-foot-and-mouth disease (HFMD) cases, and to provide reference for clinical treatment with probiotics. Methods Totally 100 severe HFMD cases were selected in study group from infection department of Xi’an Children’ Hospital from May 2013 to April 2015, and 50 healthy children taking physical examination at the same period were selected in control group. The contents of bifidobacteria and E.coli in stool were detected by Taqman real-time PCR for patient children at early stage and recovery stage and for controls. The levels of Endotoxin, DAO and D-lactate in the serum were detected by improved chromomeric substrate azo, improved method of odianisidine agent and enzymologist spectrophotometers, respectively. Results Bifidobacterialog content at early stage of severe HFMD children (8.79±0.58CFU/g) was significantly lower than that at recovery stage (9.26±0.98CFU/g) and healthy controls (9.29±0.86CFU/g) (F=3.129,P=0.048). Cases at recovery stage were not significantly different from controls in bifidobacteria content (t=0.088,P=0.930). The contents of E. coli of cases at early stage (9.20±0.84CFU/g) and recovery stage (9.03±0.82CFU/g) were significantly higher than control group (7.58±0.35CFU/g) (F=3.707,P=0.028). The contents of E. coli at early stage was not significantly different from those at recovery stage (t=0.824,P=0.413). Bifidobacteria/E. coli ratio (B/E) at early stage (0.96±0.24) and recovery stage (1.02±0.31) were significantly lower than the control group (1.23±0.46) (F=3.254,P=0.043), and there was no significant difference in B/E ratio between early stage and recovery stage (t=0.877,P=0.384). Blood endotoxin (0.53±0.10EU/mL), DAO (0.08±0.02μmmol/min per mL), D-lactic acid (5.32±0.97μmmol/mL) in study group were significantly higher than in the control group [0.48±0.09EU/mL, 0.07±0.01μmmol/min per mL, 4.96±0.90μmmol/mL] (tvalue was 2.468, 2.772, and 2.319, respectively, allP<0.05). Conclusion Intestinal flora of children with severe HFMD change, and E. coli content increases. Bifidobacteria content decreases at the early stage, and permeability of intestinal mucosa barrier changes. Thus probiotics is recommended for adjuvant treatment.

[Key words]severe hand-foot-mouth disease; intestinal flora; intestinal mucosal barrier; probiotics

手足口病是由多种肠道病毒感染引起的小儿常见传染性疾病，其中柯萨奇病毒A16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71)是手足口病的主要病原。手足口病传染性强，传播速度快，控制难度大，很容易呈现爆发流行，少数重症者可累及中枢神经系统。个别重症患儿病情发展快，可导致死亡。目前手足口病尚无特效治疗和预防方法，已成为严重威胁儿童身体健康及生命安全的主要疾病。

研究表明，肠道粘膜是病毒入侵和繁殖的主要场所[1]，肠道粘膜及其定植的肠道菌群是机体抵御病原体入侵的最重要的屏障之一。肠道菌群不仅能增强肠道粘膜的屏障功能，还有预防肠道感染的能力[2]；肠道致病菌与肠道益生菌之间相互制约与依赖，维持肠道内微生态的动态平衡。肠道菌群结构失衡会造成肠上皮通透性增加从而导致疾病的发生。本研究通过检测重症手足口病患儿在疾病初期及恢复期肠道内双歧杆菌和大肠杆菌的含量，以及肠粘膜通透性指标的变化，探求不同时期肠道菌群及肠粘膜屏障功能的变化，旨在为完善治疗方案提供依据，报道如下。

1资料与方法

1.1研究对象

研究组：入选2013年5月至2015年4月西安市儿童医院感染科收治的重症手足口病患儿100例为研究对象。纳入标准：①年龄2～5岁；②入院时病程在3天内；③临床确诊为重症手足口病；④入院经甘露醇降颅压，甲泼尼龙琥珀酸钠减轻颅内水肿，利巴韦林抗病毒，免疫球蛋白、降温、镇静、止惊等对症支持治疗7天后临床治愈的患儿。排除标准：①危重型病例；②脑发育不良或脑损伤、先心病患儿，③近2周内有腹泻病史或服用益生菌制剂、抗生素者。所有病例诊断均依据卫生部制定的《手足口病诊疗指南(2010年版)》[3]中重型手足口病诊断标准，即：精神差，出现嗜睡、谵妄、呕吐、头痛，共济失调、肢体频繁抖动、肌阵挛、眼球震颤、眼球运动障碍，无力或急性迟缓性麻痹等症状，可出现脑膜刺激征、惊厥、腱反射消失或减弱等神经系统症状和体征。所有患儿肠道病毒核酸检测均阳性。

对照组：选择同期西安市儿童医院儿保科体检的正常儿童50例。年龄2～5岁，近2周没有腹泻病史，并没有使用抗生素和益生菌。

100例重症手足口病患儿为研究对象，男60例，女40例，平均年龄3.7±1.2岁，均临床治愈出院；同时随机选择同期儿保科健康体检儿童50例作为对照组，其中男30例，女20例，平均年龄3.9±1.1岁。各组儿童性别、年龄比较均无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。

1.2标本采集

研究组患儿入院第2天清晨留取粪便作为疾病初期粪便标本，治疗1周后留取粪便作为恢复期粪便标本，对照组儿童体检时留取粪便标本，符合纳入标准的儿童粪便标本要求避免尿液、灰尘等污染，选择没有被污染的部分重量需大于1g，放置于无菌粪便收纳盒中，分别做好标记，并置于-20℃冰箱保存至粪便DNA提取。血标本的收集是被纳入研究组患儿入院次日清晨、对照组儿童体检时空腹抽取静脉血2～3mL至肝素抗凝管内，然后离心机上2 000 r/min离心5min，最后提取上层血浆放到-20℃冰箱保存直至内毒素、二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸检测。

1.3研究方法

采用荧光定量PCR技术分别检测3组儿童粪便中大肠杆菌及双歧杆菌的含量；分别采用改良基质偶氮显色法、改良邻联茴香胺试剂法和酶学分光光度计法检测研究组及对照组儿童血液中内毒素、二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸水平。

1.4统计学方法

2结果

2.1两组儿童粪便双歧杆菌与大肠杆菌含量比较

两组儿童粪便检测双歧杆菌与大肠杆菌对数值差异均具有统计学意义(P<0.05)。研究组患儿双歧杆菌含量在疾病初期对数值显著低于恢复期和正常对照组(P<0.05)，而恢复期患儿与对照组儿童双歧杆菌含量差异无统计学意义(P>0.05)；研究组患儿疾病初期和恢复期大肠杆菌对数值均显著高于正常对照组(P<0.05)，疾病初期及恢复期大肠杆菌含量差异无统计学意义(P>0.05)；双歧杆菌/大肠杆菌的比值(B/E)在疾病初期和恢复期均显著低于对照组儿童(P<0.05)，初期和恢复期B/E比值差别无统计学意义(P>0.05)，见表1。

注：*与恢复期组比较t=2.681，P=0.009,△与对照组比较t=0.088，P=0.930；#与恢复期组比较t=9.405，P<0.001；@与初期组比较t=0.824，P=0.413；§与恢复期组比较t=2.146，P=0.036，◇与初期组比较t=0.877，P=0.384。

2.2两组儿童血浆内毒素、二胺氧化酶、D-乳酸水平比较

重症手足口病患儿疾病初期血液中内毒素、DAO、D-乳酸含量与健康对照组儿童差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表2。

3讨论

手足口病是由多种肠道病毒感染引起的儿童常见传染病，其传染性强、传播途径复杂、传播速度快，容易出现短时间内暴发流行。该病的发病机制目前尚不明确。有研究报道，肠道病毒进入消化道后在肠黏膜内复制繁殖并持续释放到血液，然后传遍全身而发病，肠道黏膜是病毒入侵和增殖的主要场所[1]。人体肠道寄居着种类繁多、数量巨大的细菌群落。肠道菌群中约99%以上由乳酸杆菌、双歧杆菌等专性厌氧菌组成，其余1%为肠杆菌科细菌为主的兼性厌氧菌[4]，主要为大肠杆菌。粪便最能体现肠道菌群的总体情况，正常粪便40%是微生物，活菌高达90%以上，其中专性厌氧菌(如双歧杆菌、乳酸杆菌等)占活菌95%以上[5]。肠道正常菌群与宿主长期处于共生状态，正常菌群一方面能维持宿主正常肠道生理功能及屏障功能，同时也能拮抗外源性致病菌的入侵与定植，维持肠道免疫平衡与稳定，降低血氨及胆固醇等重要的生理作用。肠道屏障功能出现障碍，将导致内毒素及细菌移位，引起各种免疫反应及感染[6]。

3.1重症手足口病患儿肠道菌群的变化特征

本研究通过比较重症手足口病早期、恢复期与健康儿童肠道菌群的变化，探讨重症手足口病肠道菌群的变化特征和益生菌辅助治疗的依据。研究结果显示，重症手足口病患儿肠道菌群构成比例存在变化，疾病初期肠道中双歧杆菌含量显著低于恢复期和对照组，其原因可能是重症手足口病初期，由于严重的感染破坏了胃肠粘膜循环从而导致肠道的缺血/缺氧诱发了肠道菌群的紊乱。由于正常菌群结构遭到破坏，双歧杆菌显著减少，其生物拮抗功能消失，促使了条件治病菌和大肠杆菌过度增殖，因而重症手足口病初期和恢复期大肠杆菌含量较对照组显著增加；由于疾病恢复期，胃肠菌群生态未完全恢复，大肠杆菌的含量和疾病初期无显著差别。疾病初期和恢复期的双歧杆菌/大肠杆菌比值均低于正常对照组儿童，提示重症手足口病患儿存在肠道菌群紊乱，同时也提示这是益生菌治疗手足口病有效的原因之一。因此手足口病患儿可给予益生菌辅助治疗，以维持正常的肠道菌群，防止出现胃肠道菌群失衡，继而导致肠黏膜屏障功能障碍，阻止病情加重。但疾病初期和恢复期双歧杆菌/大肠杆菌比值无显著变化，可能与样本量少有关，需要大样本量的临床实验进一步证实。

3.2重症手足口病患儿肠道粘膜屏障功能的变化

血浆内毒素水平、D-乳酸水平、DAO活性测定是用来评价肠道粘膜屏障功能的重要指标[7]，上述指标升高，提示肠道粘膜屏障功能受到破坏。学者杨娟检测重症手足口病患儿血浆内毒素、D-乳酸及DAO水平，发现重症手足口病患儿上述指标均高于正常儿童及轻症患儿[8]，认为重症手足口病患儿存在肠黏膜屏障功能的损伤，肠道毒素入血导致内毒素血症，患儿出现高热、呕吐及神经系统的一系列临床表现。本研究对上述指标进行了检测，发现手足口病患儿的确存在肠粘膜通透性的明显改变，与杨娟研究结果一致。

3.3益生菌在手足口病中的应用研究

益生菌是指能够对宿主健康产生有益作用的活的微生物。肠黏膜表层的菌膜结构具有抗定植力的生物屏障功能，能有效阻止过路菌及外籍菌的侵袭。另外肠道益生菌如乳酸杆菌、双歧杆菌还通过代谢乙酸、乳酸等代谢产物降低肠道局部PH值，杀死沙门氏菌、大肠埃希菌等致病菌，并促进肠道蠕动，加速细菌、毒素等有害物质排出。研究显示益生菌对儿童及成人腹泻、慢性肠炎、泌尿系统疾病、肝胆疾病、过敏性疾病等具有明确的治疗效果[9]。陈冰蓉等(2010年)用酪酸梭菌辅助治疗儿童手足口病，发现患儿体温、疱疹消失时间及食欲恢复时间均显著缩短。魏红娟等[4]用凝结芽孢杆菌活菌片辅助治疗手足口病，观察到患儿食欲及体温恢复正常时间及疱疹消失及好转时间均显著缩短。上述研究结果一方面充分说明益生菌制剂对手足口病辅助治疗的可靠效果，另一方面也充分说明手足口病患儿的确存在肠道粘膜屏障功能的障碍。

综上所述，重症手足口病患儿肠道菌群存在紊乱情况，表现为大肠杆菌等致病菌数量显著增高，疾病初期双歧杆菌等益生菌数量较低，同时，患儿伴随肠道粘膜通透性改变，因此重症手足口病患儿建议在疾病初期给予益生菌制剂，以维持肠道正常菌群，预防肠道菌群失调继而出现的肠粘膜屏障功能障碍，阻止疾病恶化。

[1]Patel T, Gawkrodger D J. Food allergy in patients with eczema: immediate symptoms are usual, with nuts and tomatoes the major allergens[J].J Eur Acad Dermatol Venereol,2011,25(7):865-867.

[2]Sharon G, Garg N, Debelius J,etal.Specialized metabolites from the microbiome in health and disease[J].Cell Metab,2014,20(5):719-730.

[3]中华人民共和国卫生部.手足口病诊疗指南(2010年版)[J].国际呼吸杂志,2010,30(24):1473-1475.

[4]魏红娟,赵红立,任尚申,等.凝结芽孢杆菌活菌制剂在手足口病中的应用[J].临床儿科杂志,2012,30(4): 355-357.

[5]Liang J, Sha S M, Wu K C.Role of the intestinal microbiota and fecal transplantation in inflammatory bowel diseases[J].J Dig Dis,2014,15(12):641-646.

[6]Huang X Z, Zhu L B, Li Z R,etal. Bacterial colonization and intestinal mucosal barrier development[J].World Journal of Clinical Pediatrics,2013,2(4):46-53.

[7]黄永坤.胃肠道菌群和胃肠黏膜屏障的检测[J].中国实用儿科杂志,2010,25(7):516-519.

[8]杨娟,黄永坤,王美芬,等.不同类型手足口病患儿肠黏膜屏障功能测定的临床意义[J].实用儿科临床杂志,2010,25(10):731-732.

[9]Dang Y, Reinhardt J D, Zhou X,etal.The effect of probiotics supplementation on Helicobacter pylori eradication rates and side effects during eradication therapy:a meta-analysis[J].PLoS One,2014,9(11):e111030.

[专业责任编辑：史晓薇]

Correlation between intestinal flora and intestinal mucosal permeability in patient children with severe hand-foot-mouth disease

SU Yu-fei, CHEN Jing, WANG Lie, WEN Jun

(Department of Emergency, Xi’an Children’ Hospital, Shaanxi Xi’an 710003, China)

2015-12-14

苏宇飞(1973-)，男，副主任医师，硕士研究生，主要从事儿童急危重症的研究。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.03.014

R725.1

A

1673-5293(2016)03-0323-03