Trametes sp.LS-10C漆酶催化酸性铬蓝K脱色条件优化

刘　宇，汤　斌，李　松（安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心，安徽芜湖　241000）

Trametes sp.LS-10C漆酶催化酸性铬蓝K脱色条件优化

刘宇，汤斌∗，李松
（安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心，安徽芜湖241000）

用栓菌Trametes sp.LS-10C漆酶对酸性铬蓝K进行脱色，得到了LS-10C漆酶催化酸性铬蓝K脱色的最适反应条件.在给酶量10 U/m L、p H 4.5、温度45℃、染料质量浓度100 mg/L、ABTS 10μmol/L的条件下反应2 h后，酸性铬蓝K的脱色率达到79.56%.研究表明，栓菌Trametes sp.LS-10C漆酶在处理染料废水脱色领域具有研发和应用前景.

栓菌；漆酶；偶氮染料；脱色

有机合成染料根据其发色基团的结构主要分为偶氮类和蒽醌类等，其中，偶氮染料（Azo dyes）是广泛应用于纺织和印染工业中的第一大类染料［1］.偶氮染料是一类含有一个或者多个偶氮基团（-N=N-）的芳香族化合物，具有致癌、致畸或其他毒性作用［2］.在染料的生产和使用过程中，约有10%～15%的染料直接随废水一起排出，严重影响着生态系统的和谐稳定.因此，寻求经济有效的偶氮染料降解或去除方法对于生态系统的稳定和人类的健康具有重要意义.

漆酶（Laccase，EC 1.10.3.2）是多铜氧化酶家族（Multi-copperoxidases，MCOs）中最重要的一员，1883年由Yoshida在漆树（Rhus vernicifera）汁液中首次发现［3-4］.漆酶具有较高的氧化还原电势，可以催化氧化酚类化合物；在某些小分子介体（Mediators）存在的条件下，还能够氧化非酚类物质［5-6］.因此，漆酶在木质素的去除、纸浆的生物漂白、印染废水的处理以及环境保护中的生物修复等领域的应用越来越广泛和深入［7］.研究发现，漆酶可对多种偶氮染料进行有效脱色，是生物酶法处理印染废水的常用酶种之一［8-9］.

选择偶氮染料酸性铬蓝K利用栓菌Trametes sp.LS-10C漆酶进行脱色处理，研究中考察了小分子介体、漆酶用量、染料质量浓度、作用温度和p H等因素对该酸性染料脱色率的影响，以期为偶氮染料的生物酶法处理提供参考.

1　材料与方法

1.1实验材料

（1）菌株.漆酶产生菌株Trametes sp.LS-10C由安徽工程大学微生物实验室筛选并保藏于中国典型培养物保藏中心（M2015191）.

（2）培养基.PDA培养基：葡萄糖20 g/L、土豆浸出汁200 g/L、琼脂20 g/L、p H自然；种子培养基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母粉3 g/L、p H自然；发酵培养基：葡萄糖15 g/L、豆渣10 g/L、麸皮浸出汁100 g/L、NH4Cl 3.0 g/L、KH2PO41.5 g/L、CuSO4·5H2O 0.25 g/L、NaCl 1.5 g/L、MgSO41.0 g/L、Tween-80 0.3%、p H自然.

（3）主要试剂.ABTS［2，2＇-联氮基-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐］和DMP（邻苯二甲酸二甲酯）购自Sigma公司；酸性铬蓝K（Acid Chrome Blue K，ACBk，λmax=545 nm）购自上海生工生物工程技术服务有限公司；香兰素、丁香醛、HOBT（1-羟基苯并三氮唑）、阿魏酸、丁香酸、HBA（对羟基苯甲酸）等购置于上海源叶生物科技有限公司；其他化学纯或分析纯生化试剂购置于国药集团化学试剂有限公司；麸皮和豆渣，均为市售.酸性铬蓝K的结构式如图1所示.

（4）主要的仪器设备.QHZ-123B组合式全温度振荡培养箱（太仓市华美生化仪器厂）；BIOTECH-10JS-9000C自动发酵罐（上海保兴生物设备工程有限公司）；L5紫外可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；HH-601A数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；PHSJ-3F雷磁p H计（上海仪电科学仪器股份有限公司）.

图1　酸性铬蓝K的化学结构式

1.2实验方法

（1）粗酶液的制备.挑取斜面中培养的Trametes sp.LS-10C菌丝（约3 cm2）接种至种子培养基中（150 m L/500 m L），置于30℃、200 r/min培养48 h后，以10%的接种量转接于10 L自动发酵罐.发酵条件控制为：装液量7 L、溶氧30%、温度30℃、p H自然.发酵7 d后取发酵液于4℃、5 000 r/min离心30 min，收集上清液即得粗酶液，置于4℃保存备用.

（2）漆酶的分离纯化［10］.

（3）漆酶活力的测定.以ABTS为底物［11］，将等体积的0.5 mmol/L ABTS溶液与适当稀释的漆酶液置于40℃水浴中反应，测定反应前3 min内反应体系在420 nm处吸光值的变化，并且定义1 min内氧化1μmol ABTS所需要的酶量为一个漆酶活力单位（U）.其中，ABTS溶液或酶液均使用醋酸—醋酸钠缓冲液（0.1 mol/L，p H 4.0）配置或稀释并以煮沸灭活的酶液作为对照.已知，420 nm处ABTS的摩尔消光系数ε420=36 L/（mmol·cm）.

2　结果与分析

2.1介体对酸性铬蓝K脱色的影响

在漆酶催化染料脱色的过程中，介体的参与往往可以显著提升脱色效率和脱色率［12］.因此，研究在酸性铬蓝K脱色体系中分别加入香兰素、丁香醛、HOBT、阿魏酸、DMP、丁香酸、HBA和ABTS等介体至终浓度均为10μmol/L，对照组不添加任何介体，结果如图2a所示.由图2a可知，ABTS对Trametes sp.LS-10C漆酶催化ACBk脱色有明显的促进作用.ACBk脱色率是对照组的1.87倍；丁香醛和HOBT对ACBk脱色的促进作用则不明显，分别是对照组的1.27倍和1.21倍；其他介体对于该漆酶催化酸性铬蓝K脱色的影响较小.因此，选择ABTS作为LS-10C漆酶对ACBk脱色研究的最佳介体.

在反应体系中加入不同浓度的ABTS，以研究ABTS浓度对ACBk脱色的影响，结果如图2b所示.由图2b可知，在没有ABTS情况下，LS-10C漆酶对ACBk的脱色率为40.48%；并且该酸性染料的脱色率随ABTS浓度的增加而增加，最高可达到80.17%；当ABTS浓度高于10μmol/L时，该漆酶对ACBk脱色率的增加开始趋于平缓.所以，ACBk的脱色反应中ABTS的最适加入量为10μmol/L.关于漆酶/介体对染料脱色的影响在相关文献中也有报道，如Woodward［13］等研究发现HBT等介体在Trametes trogii漆酶处理工业纺织废水中具有显著的促进作用，但邻香豆酸等介体则具有强烈的抑制作用.赵敏［14］等研究发现以TEMPO为介体时能大大增强疣孢漆斑菌NF-05漆酶对橙黄G6的脱色效率.

图2　介体种类和ABTS浓度对酸性铬蓝K脱色的影响

2.2给酶量对酸性铬蓝K脱色的影响

适当稀释Trametes sp.LS-10C漆酶液并分别加入各反应体系至不同的终浓度，以研究给酶量对ACBk脱色的影响，测定结果如图3所示.由图3可知，随着给酶量的增加ACBk脱色率也相应地得到提高；当给酶量增加至10 U/m L时，ACBk脱色率基本接近最大值；继续增加漆酶用量时，ACBk脱色率趋于稳定.因此，漆酶的最适给酶量为10 U/m L.

2.3染料质量浓度对酸性铬蓝K脱色的影响

使用缓冲液将ACBk分别稀释至25 mg/L、50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L、125 mg/L、150 mg/L、175 mg/L和200 mg/L并进行脱色，结果如图4所示.由图4可知，当ACBk质量浓度从25 mg/L增加至100 mg/L时，ACBk脱色率逐渐上升至73.53%；当ACBk质量浓度继续增大至200 mg/L时，ACBk脱色率基本稳定.所以，Trametes sp.LS-10C漆酶对ACBk在100～200 mg/L质量浓度范围内脱色效果较好.

图3　漆酶浓度对酸性铬蓝K脱色的影响

图4　染料质量浓度对酸性铬蓝K脱色的影响

2.4温度对酸性铬蓝K脱色的影响

将ACBk脱色体系分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃等一系列温度下进行脱色反应，以研究脱色温度对ACBk脱色的影响，结果如图5所示.由图5可知，在20～45℃之间，Trametes sp.LS-10C漆酶对ACBk脱色率与温度呈正相关关系，45℃时ACBk脱色率达到最大值75.37%；当脱色温度继续上升，ACBk脱色率随之下降，在60℃时该漆酶对ACBk染料的脱色率下降至66.31%.因此，选择45℃作为LS-10C漆酶催化ACBk脱色的最适脱色温度.

2.5p H对酸性铬蓝K脱色的影响

用p H分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.5、6.5和7.0的缓冲溶液配置ACBk染料并进行脱色反应，以研究p H对ACBk脱色的影响，结果如图6所示.由图6可知，随着p H的增加，ACBk脱色率先增加后下降，p H 4.5时脱色率最大（74.52%）；在p H 4.0～5.0范围内，ACBk脱色率较高，基本在66%以上；当p H在5.0～7.0时，ACBk脱色率迅速下降至28.27%.因此，Trametes sp.LS-10C漆酶对ACBk的最佳脱色p H为4.5.

2.6酸性铬蓝K脱色率随时间的变化规律

根据上述实验结果，将ACBk染料的脱色反应体系控制在最优条件下进行，并延长其脱色时间至24 h，ACBk脱色率随时间的变化规律如图7a所示.由图7a可知，Trametes sp.LS-10C漆酶对ACBk的脱色率随时间的延长而增加，24 h时脱色率最高可达到83.82%.从整个反应趋势可以看出，添加ABTS可以显著提升ACBk的脱色效率（2 h，79.56%/47.18%）；随着脱色时间的延长，不添加ABTS使得ACBk脱色率仍然较低（24 h，83.82%/71.93%）.上述结果表明，ABTS不但可以提高Trametes sp.LS-10C漆酶对ACBk在脱色反应前期（0～6.0 h）的催化效率，还可以提高ACBk脱色率.这可能是因为：漆酶分子从ABTS或ACBk得到电子，将氧气还原为水；ACBk被氧化为很不稳定的阳离子自由基后，从而引发一系列反应如发色基团发生断裂等，ACBk生色结构的破坏表现为染料颜色的消失或变淡；由于ACBk空间位阻等因素，影响漆酶对该染料降解效率；小分子介体ABTS转变成阳离子自由基后，具有较高的氧化还原电势，不但能够将ACBk快速氧化脱色，还可以将漆酶较难单独降解的物质进一步氧化.上述猜想在一系列文献中得到了进一步的佐证，Baldrian［15］认为HBT等介体通过促进氧气和漆酶底物之间的电子传递进程，协助漆酶将底物氧化.Galai［16］等研究发现Stenotrophomonas maltophilia AAP56漆酶/ABTS对活性黑5脱色过程中，漆酶单独不能降解的活性黑5的偶氮连接桥部分矿化，检测到至少有5种中间产物生成.张瑞景［17］等研究表明Pleurotus sp.N3漆酶/HOBT对苯胺蓝的脱色可能是因为该染料的显色基团C=N断裂解聚生成3种中间产物.

分别对处理24 h后的反应体系和对照样品进行全波长扫描（300～800 nm），结果如图7b所示.由图7b可知，ACBk脱色液在其最大吸收波长处还有明显的特征吸收峰，表明单独使用LS-10C漆酶时ACBk的降解程度相对漆酶/ABTS体系较低，这与上述实验中获得的结果是相符的.

图5　温度对酸性铬蓝K脱色的影响

图6　p H对酸性铬蓝K脱色的影响

图7　ACBk脱色率随时间变化曲线和漆酶处理前后ACBk脱色液的吸收光谱图

3　结论

以染料脱色率为考察指标，通过单因素实验对栓菌Trametes sp.LS-10C漆酶催化偶氮染料ACBk脱色条件进行了研究.实验结果表明，部分介体对ACBk脱色效率有促进作用，而ABTS对LS-10C漆酶催化ACBk脱色的促进作用最高.研究中发现，在漆酶用量10 U/m L、p H 4.5、温度45℃、染料质量浓度100 mg/m L、ABTS 10μmol/L的条件下反应2 h后，酸性铬蓝K的脱色率可以达到79.56%，展现了Trametes sp.LS-10C漆酶在该类偶氮染料脱色中良好的处理效果，具有进一步研究和开发的价值.

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Optimization of Conditions in Decolorization of Acid Chrome Blue K by Laccase from Trametes sp.LS-10C

LIU Yu，TANG Bin∗，LI Song
（Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation in Anhui Province，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China）

Decolorization of acid chrome blue K is conducted with the laccase from Trametes LS-10C.The optimum decolorization conditions of acid chrome blue K catalyzed by laccase from LS-10C are obtained.The results show that the amount of enzyme is 10 U/m L，p H is 4.5，temperature is 45℃，the dye concentration is 100 mg/L，the ABTS concentration is 10μmol/L.Under the optimized conditions，the decolorization rate of acid chrome blue K is 79.56%after 2.0 h.The study suggests that the laccase from Trametes sp.LS-10C has research，development and application prospects in treating dye wastewater decolorization.

Trametes sp.；laccase；azo dyes；decolorization

TS193.2

A

1672-2477（2016）04-0012-05

2016-01-10

安徽省自然科学青年基金资助项目（1408085QC61）

刘宇（1988-），男，山东兰陵人，硕士研究生.

作通讯者：汤斌（1954-），男，安徽桐城人，教授，硕导.