丁苯酞对1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导细胞自噬的影响①

贾玉凤，吴庆文，程月发，陈　娟，孟　奇

丁苯酞对1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导细胞自噬的影响①

贾玉凤1，吴庆文1，程月发2，陈娟1，孟奇3

目的研究丁苯酞对1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）诱导的SH-SY5Y细胞自噬相关因子的影响，探讨丁苯酞对帕金森病细胞模型的神经保护作用机制。方法将SH-SY5Y细胞分为空白对照组（A组）、MPP+组（B组）、雷帕霉素预处理+MPP+组（C组）和丁苯酞预处理+MPP+组（D组）。采用噻唑蓝（MTT）比色法测定细胞相对存活率，倒置相差显微镜观察细胞形态的变化，Western blotting检测微管相关蛋白1轻链3（LC3）-Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1蛋白表达，RT-PCR检测LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1 mRNA表达。结果B组SH-SY5Y细胞存活率显著低于A组（t=20.270，P＜0.001），C组和D组显著高于B组（t＞8.770，P＜0.001），且C组和D组间无显著性差异（t=2.270，P=0.064）。与A组相比，B组LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1蛋白和mRNA表达明显增加（t＞6.647，P＜0.01）；C组和D组明显高于B组（t＞3.630，P＜0.01），C组与D组间无显著性差异（t＜2.238，P≥0.05）。结论丁苯酞可以提高MPP+诱导的SH-SY5Y损伤细胞存活率，其可能通过诱导帕金森病模型细胞自噬，发挥治疗作用。

丁苯酞；帕金森病；SH-SY5Y细胞；自噬；大鼠

［本文著录格式］贾玉凤，吴庆文，程月发，等.丁苯酞对1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导细胞自噬的影响［J］.中国康复理论与实践，2016，22（4）：422-427.

CITED AS：Jia YF，Wu QW，Cheng YF，et al.Effect of butylphthalide on autophagy of SH-SY5Y cells induced by l-methyl-4-phenyl-pyridiniumion［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（4）：422-427.

1　材料与方法

1.1细胞株

SH-SY5Y细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.2药物与试剂

丁苯酞：中国食品药品检定研究院。MPP+、噻唑蓝（MTT）：SIGMA公司。DMEM/F12=1∶1培养基、胰酶（trypsin）、胎牛血清（FBS）：GIBICO公司。磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GADPH）抗体：华安生物技术有限公司。LC3抗体：MBL公司。Beclin 1抗体：北京博奥森生物工程有限公司。引物由INVITROGEN公司设计合成。

1.3仪器

CO2培养箱（Thermo Scientific Forma）、酶标仪、PCR仪、Gel DocTM EZ Imager：意大利BIO-RAD公司。倒置相差显微镜、荧光显微镜：OLYMPUS公司。超净工作台：中国苏州净化设备厂。低温离心机：日本日立公司。凝胶成像系统：意大利BIO-RAD公司。

1.4方法

1.4.1细胞培养及分组

将SH-SY5Y细胞株置于DMEM/F12=1∶1培养基（含10%的胎牛血清，青霉素100 U/ml，链霉素100 U/ml），37℃，5%CO2孵育箱中培养，2～3 d换一次培养基，在倒置显微镜下观察细胞生长状态，待达到80%～90%细胞汇合后，按1∶2对细胞进行传代，选取对数生长期的细胞进行实验。实验共分4组，分别是空白对照组（A组）、MPP+组（B组）、雷帕霉素预处理+ MPP+组（C组）和丁苯酞预处理+MPP+组（D组）。

A组：细胞正常含血清培养基进行培养。

B组：待达到70%～80%细胞汇合后的3 h之后向培养基中加入1 mmol/L的MPP+继续培养至24 h。

C组：待达到70%～80%细胞汇合后向培养基中加入200 nmol/L的雷帕霉素培养3 h后再加入1 mmol/L的MPP+继续培养至24 h。

D组：待达到70%～80%细胞汇合后向培养基中加入10 μmol/L丁苯酞培养3 h后再加入1 mmol/L的MPP+继续培养至24 h。

1.4.2 MTT比色法

采用MTT比色法检测细胞存活率。以每孔（1～5）× 104个/ml的活细胞悬液100 μl接种于96孔板中，细胞干预情况同上，分别加入50 mg/ml的MTT 15 μl继续孵育3 h，吸去培养基，加入150 μl的DMSO，摇床15 min，酶标仪490 nm波长检测吸光度值（OD值），计算细胞生长抑制率，实验重复6次。计算公式：

1.4.3 Western blotting

采用Western blotting检测自噬相关蛋白的表达情况。细胞干预情况同上，每孔加入100 μl裂解液，用细胞刮刮掉细胞，放入EP管中，超声打碎，离心，取上清。用BCA试剂盒检测样品浓度进行蛋白定量。蛋白变性，SDS-PAGE电泳，采用湿转转膜，5%牛奶封闭1 h，LC3单克隆抗体（1∶1000），Beclin 1（1∶500）、GAPDH（1∶1000）一抗4℃摇床过夜，TBST洗3次，每次5 min，二抗37℃孵育1 h，TBST洗3次，ECL显色，用Image J软件对结果进行分析，条带灰度值表示蛋白表达含量，用内参GAPDH进行校准，计算各组蛋白相对表达含量。以上实验重复6次。

1.4.4 RT-PCR

细胞干预情况同上，按Trizol试剂说明书提取细胞总RNA；用Q3000型微量分光光度计测RNA浓度，根据所测浓度，计算出各组所需RNA的体积；按反转录试剂盒进行cDNA合成；配置引物（引物序列见表1）；根据这4个基因序列的不同特点，进行RT-PCR扩增，反应条件为94℃预变性4 min；94℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，40个循环；最后72℃延伸5 min，4℃保存。其中退火温度依次为LC3-Ⅰ，58.5℃；LC3-Ⅱ，57℃；Beclin 1，60℃；β-actin，57℃。PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，Gel DocTMEZ Imager扫描成像，用Image J软件对结果进行分析，条带灰度值表示基因表达含量，用内参β-actin进行校准，计算出各组mRNA相对表达含量。以上实验重复6次，取平均值。

表1　引物序列

1.5统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料用（x¯±s）表示，采用单因素方差分析，组间比较采用t检验。显著性水平α=0.05。

2　结果

2.1细胞存活率

与A组比较，B组细胞存活率显著降低（P＜0.001）。与B组比较，C组和D组细胞存活率显著降低（P＜0.001）。C组和D组间无显著性差异（P＞0.05）。见表2。

2.2 LC-3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1蛋白的表达

B组LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1蛋白表达量明显高于A组（P＜0.01），C组和D组LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1蛋白表达量明显高于B组（P＜0.01），C组和D组间无显著性差异（P≥0.05）。见表3、图1。

2.3 LC-3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1 mRNA的表达

B组LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1 mRNA表达量明显高于A组（P＜0.01），C组和D组LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1 mRNA表达量明显高于B组（P＜0.01），C组和D组间无显著性差异（P＞0.05）。见表4、图2。

2.4细胞形态

B组的细胞大部分胞体肿胀变圆，突起结构减少，贴壁细胞数目减少；C组和D组与B组相比，贴壁细胞增多，胞体和轴突完整，细胞间的突起联系增多且细胞形态逐渐接近A组。见图3。

表2　各组SH-SY5Y细胞存活率比较（%）

图1　Western blotting检测各组细胞LC-3Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1蛋白表达水平

图2　RT-PCR检测各组细胞LC3、Beclin 1 mRNA表达水平

图3　各组细胞形态学的变化（光镜，100×）

表3　各实验组细胞LC3-Ⅱ/Ⅰ及Beclin 1蛋白相对表达量

表4　各组细胞LC3-Ⅱ/Ⅰ及Beclin 1的mRNA相对表达量

3　讨论

研究表明，丁苯酞具有抗氧化应激、保护线粒体，减少活性氧等功效［10-11］。Huang通过研究丁苯酞对细胞凋亡的保护作用机制发现，丁苯酞可降低由MPP+诱导对细胞产生的毒性作用，抑制线粒体的膜电位发生变化，减少细胞的氧化应激作用，增加细胞中谷胱甘肽的含量，同时也可降低α-突触核蛋白的累积，进而减少路易小体的形成［12］。基础研究及临床研究均表明，丁苯酞对帕金森病有确切疗效［13］。

自噬是细胞自我保护、自我更新的一种重要机制［14］。氧化应激导致受损线粒体的降解及因泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）障碍而无法降解的异常蛋白的降解均需要自噬的参与［15-17］，及时降解多余的、受损的及衰老的蛋白与细胞器，可以防止氧化应激的级联反应，同时也为细胞重建、再生和修复提供必需原料，维持细胞内稳态。

自噬受各种信号因子的调节影响，其中mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是雷帕霉素的靶分子，能抑制自噬的发生，而使用雷帕霉素抑制mTOR的活性能激活自噬。Beclin 1是酵母自噬相关基因Atg6/ Vps30的哺乳动物同源基因，参与自噬体形成的初始步骤［18］。其通过与Bcl-2、UVRAG、mVps34、Barkor、死亡相关蛋白激酶1（death associated protein kinase 1，DAPK1）的相互作用调节细胞自噬［19-20］。有研究将表达Beclin 1的慢病毒转染至α-突触核蛋白转基因小鼠的大脑内，α-突触核蛋白在边缘系统的积聚减少，神经元突触和树突的病理改变在一定程度上得以改善［21-22］；而Beclin 1水平的下调可能导致自噬不足，从而加剧神经退行性疾病的进程［23］。当自噬程序启动时，新合成的LC3前体经加工形成其胞质形式LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ被Atg7激活转变成Atg3，并在其羧基端剪切22个氨基酸残基形成LC3-Ⅱ，最终与磷脂（磷脂酰乙醇胺）结合形成膜连接的LC3-Ⅱ［24］。因此LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的转变是自噬体形成的标志。

本研究结果显示，4组中LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1的蛋白表达及mRNA的表达依次增多，提示自噬途径被激活，但由于MPP+组自噬的防御功能得不到充分发挥，过量的活性氧、异常聚集的α-synuclein及受损的细胞器将诱导细胞进入凋亡途径，导致细胞死亡［25］。当给予细胞丁苯酞或雷帕霉素预处理后，LC3-Ⅱ/Ⅰ和Beclin 1的蛋白表达及mRNA的表达均较MPP+组明显升高，说明丁苯酞起上调自噬的作用。同时，两预处理组细胞存活率也有所改善，说明适度提高自噬水平有助于保护受损的神经元细胞，这与Crews等的研究结果［26］一致。

由上述研究结果可推测，丁苯酞可能通过上调自噬水平，防止受损细胞发生继发性损伤来发挥保护作用，进而控制帕金森病的发生发展，提高帕金森病患者生存质量。

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Effect of Butylphthalide onAutophagy of SH-SY5Y Cells Induced by l-methyl-4-phenyl-pyridiniumion

JIA Yu-feng1，WU Qing-wen1，CHENG Yue-fa2，CHEN Juan1，MENG Qi4
1.College of Nursing and Rehabilitation of North China University of Science and Technology，Tangshan，Hebei 063000，China；2.Jitang College of North China University of Science and Technology，Tangshan，Hebei 063000，China；3.West China School of Public Health，Sichuan University，Chengdu，Sichuan 610041，China
Correspondence to WU Qing-wen，CHENG Yue-fa.E-mail：wxywqw@163.com（WU Qing-wen）；arthurcyf@163. com（CHENG Yue-fa）

Objective To observe the effects of butylphthalide on the expression of autophagy-related protein and mRNA in l-methyl-4-phenyl-pyridiniumion（MPP+）-induced SH-SY5Y cells，and to explore the protective effect and possible mechanism of butylphthalide to the cell model of Parkinson's disease.Methods The SH-SY5Y cells were divided into control group（A），MPP+group（B），rapamycin pretreated+MPP+group（C）and Butylphthalide pretreated+MPP+group（D）.The relative viability of SH-SY5Y cells induced by MPP+was measured with MTT assay，the morphology of SH-SY5Y cells was observed.The expression of microtubule associated protein 1 light chain 3（LC3）-II/I and Beclin 1 protein was detected by Western blotting.And the expression of LC3-II/I and Beclin 1 mRNA were assayed by real-time quantitative reverse transcription-PCR（RT-PCR）.Results The viability rates of cells were significantly lower in group B than in group A（t=20.270，P＜0.001），and were significantly higher in groups C and D than in group B（t＞8.770，P＜0.001），however，there was no significantly difference between groups C and D（t=2.270，P=0.064）.The expression of LC3-II/I and Beclin 1 was higher in group B than in group A（t＞6.647，P＜0.01），and was higher in groups C and D than in group B（t＞3.630，P＜0.01），however，there was no significantly difference between groups C and D（t＜2.238，P≥0.05）.Conclusion Butylphthalide could prevent the injury of SH-SY5Y cells induced by MPP+，which may affect Parkinson's disease by inducing autophagy.

butylphthalide；Parkinson's disease；SH-SY5Y cells；autophagy；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.04.011

R742.5

A

1006-9771（2016）04-0422-06

河北联合大学博士科研启动基金项目（No.35647699）。

1.华北理工大学护理与康复学院，河北唐山市063000；2.华北理工大学冀唐学院，河北唐山市063000；3.四川大学华西公共卫生学院，四川成都市610041。作者简介：贾玉凤（1988-），女，汉族，河北唐山市人，硕士研究生，主要研究方向：神经康复。通讯作者：吴庆文（1966-），女，博士，教授，硕士研究生导师，主要研究方向：康复医学、神经康复。程月发（1967-），男，博士，教授，硕士研究生导师，主要研究方向：药理学。E-mail：wxywqw@163.com（吴庆文）、E-mail：arthurcyf@163.com（程月发）。

帕金森病（Parkinson's disease）是一种以黑质纹状体致密部的多巴胺能神经元进行性丢失、α-突触核蛋白大量沉积为主要病理特征的神经退行性疾病［1］，其病因及确切的发病机制目前尚未明确。近年研究证实自噬途径异常调控在帕金森病的发生、发展过程中起着重要的作用［2-3］。

自噬是细胞对外源性刺激的重要适应性反应［4］，其作为真核细胞中普遍存在的一种溶酶体依赖型途径，对应激状态下细胞存活、清除神经细胞内衰老的细胞器或错误折叠与聚集的蛋白质具有重要作用。适度调节自噬水平已经成为预防或治疗神经退行性病变的一条重要途径［5-6］。

丁苯酞为脂溶性的药物，可以直接通过血脑屏障发挥作用，具有改善线粒体功能、抗氧化应激、抑制凋亡、促进神经元再生、稳定内皮细胞等多种作用［7］，现已应用于帕金森病的临床治疗［8］。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是衰老和衰老相关疾病的一个关键性调节因子。雷帕霉素（rapamycin，RAPA）可通过抑制mTOR通路，诱导和促进细胞自噬［9］。

1-甲基-4-苯基吡啶离子（l-methyl-4-phenyl-pyridiniumion，MPP+）是神经毒素1-甲基-4-苯基-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）在脑内的代谢产物，它能够特异抑制线粒体复合物Ⅰ，导致黑质多巴胺能神经元死亡，而人体神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞具有多巴胺能神经元特性，因此，MPP+刺激神经细胞能够构建帕金森病的细胞模型，这也是国内外广泛应用的帕金森病细胞模型。

本研究采用MPP+诱导SH-SY5Y细胞建立帕金森病细胞模型，以自噬促进剂雷帕霉素为对照，观察丁苯酞预处理后，细胞存活率、形态变化和自噬相关因子Beclin 1和微管相关蛋白1轻链3β（microtubule associated protein 1 light chain 3β，LC3β）的表达及变化，探讨丁苯酞治疗帕金森病的作用机制。

（2015-11-16

2015-12-28）