基于电化学分析法定量检测MicroRNA的生物传感器

李甫梧 王丽华 宋世平

（中国科学院上海应用物理研究所 嘉定园区 上海 201800）

综述

基于电化学分析法定量检测MicroRNA的生物传感器

李甫梧 王丽华 宋世平

（中国科学院上海应用物理研究所 嘉定园区 上海 201800）

就miRNA电化学法检测中探针材料选择、信号放大方式、电极传感界面调控以及电化学检测方法在研究辐射对miRNA表达的影响方面的潜在应用等方面进行综述。

MicroRNA，癌症，生物标记物，电化学，生物传感器

miRNA在基因的表达调控、细胞分化和凋亡中都发挥着重大的作用。更有进一步的研究表明，miRNA和癌症也有着高度的相关性，miRNA在肿瘤和正常组织细胞内表达水平具有显著性差异。检测体内疾病特异性miRNA可以更加有效地诊断、监控和评估疾病，并且可以帮助我们确定个体病人最佳的使用药物。因此，miRNA检测技术的发展可以加速个性化诊断和精准医疗的进程［7］。更值得一提的是，最近研究发现miRNA也稳定存在于血清和其他体液中［8］。目前有研究表明，对血清中和疾病相关的miRNA检测可用于疾病的早期诊断［9］。现已发现乳腺癌、恶性胶质瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、肝癌、甲状腺乳头状癌、宫颈癌、成神经细胞瘤和卵巢癌的肿瘤细胞中miRNA表达量均有异常［10］。

由于miRNA的长度很短，并且通常miRNA的浓度很低，想要在临床上准确地检测仍然具有很大的挑战［11］。虽然Northern blotting是检测miRNA的标准方法，常用来评价其它的检测miRNA方法的可靠性，然而这个方法不仅需要很大的工作量和时间来完成，而且其灵敏度较低，还需要大量的RNA样品［12-13］。Real-time PCR（RT-PCR）最大的缺点是价格昂贵，不仅购买整套的机器系统价格昂贵，其维持和运行费用也相当可观，普通实验室难以开展此项目，使其使用受限，并且使用该门技术还需要经过专门的训练［14］。因此，近几年很多有别于RT-PCR和Northern blot新方法被提出来。新方法基于不同的检测方式，包括比色法［15］、测序［16-17］、微阵列［18］、拉曼散射［19］、电化学发光［20］、荧光法［21］和电化学［22］等。这些方法不仅减少了步骤上的复杂性，并且降低了成本［23］，本文主要对电化学分析法进行阐述。电化学分析方法具有高灵敏度、高特异性、操作简单、低成本、快速和检测仪器尺寸小等优点［24-25］，因此，近些年来越来越多的研究团队将电化学分析方法用于miRNA的检测。Gao等［26-27］最先利用电化学方法在检测miRNA上进行了尝试，并以DNA作为捕获探针（Capture probes， CPs），通过与miRNA杂交后将电信号放大达到了80 fmol/L的检出限，检测范围80～200 pmol/L。

1 miRNA生物传感器的灵敏度

由于细胞内、血清和唾液中miRNA浓度很低，而且浓度范围大（在人血清中从0～1 pmol/L［28］），因而更宽的检测范围和更低的检出限是研究人员一直追求的。最常用的策略包括使用与miRNA亲和力更高的PNA或LNA作为探针材料，或者使用更有效的信号放大系统提高传感器的检出限和检测范围。若要应用于临床，还应注意方法的简便性和成本的控制。

1.1miRNA生物传感器的探针材料

寡聚核苷酸（大多为DNA）合成方便而且价格便宜，研究人员最常用的是利用寡聚核苷酸作为CPs，但由于其带有磷酸基团且空间结构的不太稳定性，给miRNA检测的灵敏度带来了一定的阻碍。后来肽核酸（Peptide nucleic acid， PNA）和锁核酸（Locked nucleic acid， LNA）的发现为miRNA的检测提供了很好的工具。DNA、PNA、LNA结构单元见图2。

1.1.1 以肽核酸作为探针

PNA是一种核酸类似物，最初由Nielsen等［30］合成。他们用非手性的聚酰胺骨架代替了磷酸和脱氧核糖构成的PNA的基本骨架（图2）。随后Egholm等［31］证明了其与互补配对也遵循Watson-Crick碱基互补配对原则，并且由于其不带与miRNA相同的电荷，极大地增强了和miRNA的亲和力。同时，由于其不会被细胞中的酶降解，因而可以为miRNA的胞内定量分析提供更可靠的探针［32］。

Fan等［33］以PNA为CPs，使用导电聚合物纳米线的方法用于对miRNA进行检测。他们将PNA固定到有100对相互连锁的梳子状的纳米间隙的阵列（Nano-gapped array）上。在与 PNA 序列互补的miRNA杂交后，为CPs上带去了净负电荷后与苯胺/辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）/H2O2共同孵育，质子化的苯胺分子附着到带负电的miRNA-PNA双链上，形成聚苯胺纳米线。然后这些纳米线被参杂着HCl的蒸汽扩充，创建了一个导电网络，桥接了这个生物传感器阵列的间隙。检测范围10～20 pmol/L，检出限可以达到5 fmol/L。Gao等［34］将生物素化的 PNA 作为探测探针（Detection probes， DPs），修饰有Avidin的葡萄糖氧化酶特异性吸附在一起形成复合物（GOx-DPs），当环状的CPs（5′端和3'端分别含有与miRNA和DPs的互补序列）和靶标miRNA结合后环状CPs，就露出DPs的结合部位，在GOx-DPs结合到CPs上后加入葡萄糖反应即可产生氧化还原信号。最适条件下其检出限达到4.0 fmol/L，范围4.0～10 pmol/L。

1.1.2 以锁核酸作为探针

LNA最早由Neely等［35］用于miRNA检测分析。LNA是一种新型核酸，包含了RNA的核糖环的2′的氧原子和4′ 的碳原子连接起来的亚甲基（图2），可以减少核糖构象的多样性并且增加磷酸骨架部分区域的稳定度［36］。基于这个结构，LNA对与其互补的DNA或者RNA序列具有很高的亲和力［37］。当使用LNA作为探针时，与传统的RNA或DNA寡聚核苷酸链作为探针相比，灵敏度提高大约10倍［38］。也有文献报道，若使用颈环 LNA作为捕获探针可以提高其选择性和灵敏度［39］。

Yin等［40］的研究中以LNA作为探针，功能化的金纳米颗粒（Au nanopaticles， AuNPs）作为信号放大系统，AuNPs上包被了一段LNA和若干与Biotin修饰的DNA。实验中所用电极为石墨烯和树突状的纳米金修饰的玻璃碳复合物，探针上带有与靶标miRNA和AuNPs上的LNA互补的序列，是一个不带荧光基团和淬火基团的分子信标。当靶标miRNA与探针互补后，这个茎环结构的分子信标被打开与miRNA互补配对形成双螺旋结构，露出和 AuNPs上 LNA互补序列，并将其固定在电极表面。再加入Streptavidin-HRP，在室温下孵育后加入底物对苯二酚和 H2O2产生电化学信号，其检出限可以达到0.06 pmol/L。后来Yin等［10］在原来的基础上，使用了带有两种不同序列LNA（S4， S5）功能化的AuNPs可以被作者设计的“桥状”双链DNA所捕获。组成这个“桥状”的双链DNA的两条脱氧核苷酸链的中间一段序列是互补配对的，两端以两条相互独立的单链的形式存在。一端用于与两个带有 S4序列LNA的相连，另一端的两条单链其中一条与S5相连，而另外一条在CPs与miRNA杂交环形结构打开后，露出的5′ 端有其互补序列（图3）。

这样的设计将其上一个研究工作的信号进一步放大，其检出限达到了6fmol/L［10］。这些技术利用酶联反应和一些纳米材料对信号进行放大，并加入对核酸亲和力更高的PNA或者LNA作为CPs，得到了足够高的灵敏度［41］。

1.2信号放大系统

由于 miRNA的长度很短，而且在细胞内的浓度很低，仅依靠miRNA本身所带的负电荷为电极表面带去的电信号很难检测到或准确测量，因此我们必须借助于一定的信号放大系统来增强传感器的灵敏度。最常用的是体系中加入一些电化学活性分子或是使用 HRP催化其底物发生氧化还原反应进而给电极带去电信号［12，40］，从而实现信号的放大。

Heeger等［42］利用二茂铁作为信号输出原件，将一段一端修饰巯基另一端连有一个二茂铁分子的捕获探针自组装到金电极表面，这段探针具有类似于荧光分子信标的茎环结构。在未发生杂交反应时，探针处于茎环构型，末端连接的二茂铁分子处于电极的近端，而当溶液中含有靶序列时，由于杂交反应的发生使茎环结构打开，形成双链DNA的刚性结构，末端连接的二茂铁分子就会从电极的近端移动到远端。这种距离的改变导致电子传递效率发生变化，通过检测二茂铁分子氧化还原电流的变化可以方便而快速地指示杂交反应的发生，这个方法的检出限大约为30 pmol/L。在这个设计中，当有一个靶标miRNA分子和探针结合时仅能带给电极表面一个二茂铁的氧化还原信号，因而限制了这个传感器的灵敏度。在Wang等［26］2012年的研究中，同样也以二茂铁作为氧化还原信号介质。他们以修饰有链霉亲和素的AuNPs作为载体，将大量二茂铁固定在AuNPs表面实现信号放大。将生物素标记的和目标miRNA序列相同的寡聚核苷酸和目标miRNA共同竞争固定化在电极上的探针。伏安法定量分析miRNA的浓度将在生物素标记的DNA链和二茂铁包被的AuNPs发生络合反应后完成。二茂铁产生的氧化电流信号和目标miRNA浓度成反比，检测范围10～2.0 pmol/L，检出限达10 fmol/L。与此相似，Wang等［43］在金微电机上固定了一个修饰了甲基蓝（Methylene blue， MB）的三个茎环结构DNA探针，当miRNA和探针结合后，带有MB的一端会靠近电极表面，从而得到一个电子转移的信号，检测限达到了0.1 fmol/L，并且有一个较宽的检测范围（亚fmol/L到nmol/L）。MB在电化学生物传感器中是一种非常常用的氧化还原指示剂［44］。Yang等［45］以PNA为探针，建立了一个依赖于Ru（III）积累在固定于电极表面的核酸上的氧化还原系统，其信号放大包括铁氰化物和Ru（III）的再生，实现了10 amol/L的检出限，在当时是灵敏度最高的miRNA传感器。Labib等［28］对比了向反应液中同时加入K3［Fe（CN）6］和［Ru（NH3）6］Cl3相比不加入的这两种物质的反应液可以引起电流强度的增强。Wu等［46］设计了一种利用可以使目标miRNA不断地打开固定在电极表面的茎环捕获探针并再释放回溶液中的策略，实现对信号的再一次放大，达到0.35 fmol/L的检测限。

滚环扩增（Rolling-circle amplification， RCA）是一种等温核酸放大系统［47］，RCA不仅可以被应用在电极表面［48］，也可以被用在金纳米颗粒等纳米材料上［49］。现已经广泛应用在生物传感器中，它具有很好的信号增强作用。Tian等［50］设计了一种基于茎环探针引发的固相滚环扩增，他们使用碳纳米管（Carbon nanotube， CNT）作为一种固相基底，识别目标miRNA的茎环探针结合在碳纳米管上。当靶标出现时，茎环结构会被打开，引发 RCA过程，该工作得到了1.2 fmol/L的检测限。M iao等［51］的工作更是创造性的把RCA嫁接到DNA四面体纳米结构上，得到了50 amol/L极低的检测限。

2 信噪比控制

越来越多的研究喜欢利用自组装的方式将CPs固定到电极上，在固定化过程中，由于探针之间可能存在连续的、较长的互补序列，因而在固定化之后随着温度的降低可能会引起探针之间形成局部的双螺旋，从而导致测量上的误差。不仅如此，还因为探针上某些特定的官能团能与电极表面发生特异性吸附（碱基上的N与金电极表面），因此就有必要通过特定的手段来提高杂交捕获效率，降低非特异性吸附，从而改善传感检测的信噪比。

2.1电极表面修饰

在先前报导的工作中，各式各样的工作电极被应用到 miRNA检测中，包括铟锡氧化物［52］、Ag/AgCl、石墨［53-54］、铂丝［54］、石墨烯复合材料［55］、玻璃碳［56］、滴汞电极［57］、碳纳米管［58］和金［59-61］等。

2010年，Pohlmann等［62］将一种新的检测模型应用到电化学检测miRNA方面。是一种通过“缺口”杂交的方法。当miRNA不存在时，CPs和DPs之间无法被填满，碱基堆积力无法固定杂交的复合物，会发生摇晃。当miRNA和Gap序列杂交后，报告酶蛋白（Reporter enzyme）可以为电极界面带去酶促反应产生的电化学信号。在这个方法中，作者使用金作为工作电极，Au-S化学工艺无疑对寡聚核苷酸探针分子通过自组装的方式固定化到金电极表面带来了极大的便利［63］。在先前提到的Yin的工作中也将CPs或DPs通过该工艺固定于Au表面［10，40］。由于DNA在电极表面易发生倒伏等情况，后来的工作中对电极表面进行了各式各样的修饰。

由于金表面很容易修饰官能团，尤其是带硫基的化合物，因此越来越多的研究人员用金作为工作电极。通过在金电极表面修饰一些其他的化合物如硫基己醇（Mercaptohexanol， MCH）［64］、二硫苏糖醇（Dithiothreitol， DTT）［65］、己二硫醇（Hexanedithiol，HDT）来保护电极表面，他们通常还被混合使用。这种通过HDT对寡聚核苷酸3'末端-OH集团的修饰，可以减少探针单层自组装的非特异性吸附，并且可以更好地保证固定好的探针处于一种直立的状态以提高杂交的效率［23］。通常有图4中这种二元、三元分子组成的单层界面（图4）。Zhang等［24］就利用硫基己醇去阻断金电极表面以减少表面的非特异性吸附方面进行了尝试。Wang等［26］利用1-乙硫醇去提高探针和miRNA杂交的效率。

利用硫基己醇等对金电极表面修饰可以一定程度上调整DNA探针密度，以及防止其倒伏与电极表面进而影响进一步的杂交，增加探针和靶序列结合的效率，使实验结果可信度更高。

2.2探针密度控制

探针的组装密度对杂交效率有着很大影响，并不是越多越好，主要体现在当探针过密时，带负电荷的探针与同样带负电荷的具有互补序列的靶标核苷酸链的静电排斥力就越强，进而使杂交反应难以进行。另外，因为杂交反应发生在固液界面上，过大的密度会增加靶序列与探针杂交时的空间位阻，位阻会降低靶序列与探针的接触机会［66］。DNA的组装也会被很多因素所影响，比如两条链之间的静电排斥，分子间的聚合，碱基上的氮原子会和金电极表面发生非特异性的相互作用和双链之间较强的相互作用等（图5）。实际情况并没有文章中的示意图那么完美。

为了解决以上问题，Fan的研究组将DNA四面体纳米结构作为探针的支架，称为四面体结构探针（Tetrahedron-structured probe， TPS）。DNA四面体纳米结构由3条经硫醇化的55 nt的DNA片段和一条带有探针序列的DNA片段组成。将4条单链化学计量相等地混合在缓冲溶液中，加热到 95 ℃变性后快速地降温到 4 ℃，它们就能分层次地组装起来。这个3D的纳米结构可以通过3个在四面体底部的硫醇与金表面共价相连可以容易且很稳定地锚定在金的表面，将未杂交的探针留在顶部［68］（图6）。

这个3D的DNA构架在溶液中具有力学上的刚性，又具有结构的稳定性。除了以上的优点以外，四面体的结构同样为DNA探针提供了一个严格的构架并且使得探针与探针之间保持一定的空间，为下一阶段的杂交降低空间上的障碍［69］。

Fan的课题组在miRNA检测中使用了辣根过氧化物酶（HRP）用于信号放大，同时采用了三明治夹心法（Sandwich-type）检测方式。首先将TPS固定于金电极表面，四面体顶点的探针带有部分和目标miRNA互补的序列（Probe 1）。生物素标记的DNA单链作为信号探针（Probe 2），带有与miRNA互补的另外一部分序列。当三者同时出现在溶液中时，由于碱基的互补配对和碱基堆积力的共同作用下形成一种Probe 1: miRNA: Probe 2的三明治结构。Probe 2上的生物素可以特异性地和avidin-HRP或者多聚HRP（PolyHRP80）结合，加入底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（3，3′，5，5′ tetramethyl-benzidine， TMB）和H2O2就可以产生电量的电化学电流信号。当使用Poly-HRP80时可以检测浓度为10 amol/L的miRNA（100 μL内含有600分子），灵敏度比使用Avidin-HRP降低了三个数量级。更值得一提的是基于PolyHRP80的电化学miRNA传感器可以测量9个数量级内的浓度［70］。后来他们再在基于DNA四面体结构的基础上，将四面体结构的顶部的探针换成茎环（Stem loop）形的探针（Probe 1）。Probe 1上带有与待测miRNA和与生物素相连的DNA单链（Probe 2）的互补序列。这个模型的生物传感器的检出限达到了 1 fmol/L［12］。与上一个方法不同的是环形的DNA单链可以降低非特异性杂交，并且增加了CPs与miRNA和DPs互补序列的长度，增强了他们形成的双螺旋的稳定性，从而增加其特异性以提高检测结果的可靠性。在这次研究中，他们依然使用HRP以TMB和H2O2作为底物，用于信号放大作用。Tang等［51，71］同样也利用DNA四面体纳米结构上电极界面调控做了很多尝试。利用 RCA和链置换反应作为放大体系在对miRNA进行检测时也达到了很好的检测效果。

文中所举的例子可以很好地体现出DNA四面体纳米探针应用于电化学生物传感的优势，除了上文中提到DNA四面体纳米探针在力学上和调节探针空间分布上的具有的一些优势之外，它还可以控制DNA探针的朝向，使探针不会倒伏在电极表面而影响进一步的杂交，使DNA纳米探针从一维进化到了三维结构。相较于硫基己醇、1-乙硫醇等对电极的修饰来说，DNA纳米结构可以更好的控制DNA探针的朝向，能使探针在电极表面分布更均一，能更好地去操控整个传感界面。

2.3辐射与miRNA

研究表明，一些miRNA的表达水平和该细胞系对辐射敏感性有很大的相关性。王等［72］研究了不同辐射抗拒鼻咽癌miRNA表达水平差异的研究。发现不同辐射抗拒NPC细胞株CNE -1和CNE-2细胞的m icroRNA的表达有差异；差异表达的miRNA与放疗敏感有关。孙等［73］研究了氚水内照射和Co-60 γ射线外照射诱发小鼠肝组织miRNA表达改变，筛选电离辐射损伤的特异性 miRNA，探讨miRNA在电离辐射损伤中的功能及 m iR-34a在辐射损伤时对细胞周期的调控机制应用miRNA芯片技术对小鼠肝组织miRNA改变进行分析，Real-time PCR方法验证筛选出的差异miRNA表达。p53依赖途径诱导细胞凋亡是辐射杀伤肿瘤细胞的机制之一，肖等［74］的研究表明，miR-34c对肺腺癌细胞A549细胞系有辐射增敏效应，可强化p53蛋白的表达，诱导细胞在细胞周期的G1/G0期阻滞和凋亡。在这些研究中，对 miRNA的检测大多数是利用miRNA芯片技术或 Real-time PCR技术对相应miRNA进行检测，这些方法不但昂贵，且耗时。另外Real-time PCR容易由于反应过程中的污染带来假阳性的结果。因此，若上述电化学检测技术能应用到这些研究中去，可以得到更精确辐射和miRNA表达水平的定量关系。

2.4当前癌症检测方法与miRNA电化学检测法

辐射在医学领域应用以来，为患者制造了巨大利益，但也存在对健康不利的影响。目前对癌症检测最常用的影像学检查手段包括超声，计算机断层显像［75-76］，磁共振显像和正电子发射断层显像等。但即使是其中最先进、最准确的方法肿瘤检出直径至少也要在2～3 mm，才可以确认肿瘤的形成，小于该直径则被认为是正常的突起。另外利用影像学方法检查过程中患者会被暴露在一定剂量的射线中，对身体造成伤害，一旦过量并具有导致癌症的风险［77］。但对血清中miRNA检测是一种非侵入式的方法，为患者在诊断或是对预后进行评估时极大限度减少了对患者的伤害，且更适用于普查。因此，利用检测血清中的循环miRNA相比目前主流的几种影像学方法要更温和，对人体伤害降至最低。

3 总结与展望

miRNA的重要性已经受到广泛地认可，并且miRNA可以在血清中稳定存在，对人类疾病（癌症）的诊断和预测提供了很好的思路。目前有越来越多的检测方法应用于miRNA的检测中。PNA及LNA的引入也在一定程度上提高了探针和靶标 miRNA检测的亲和力，各种各样极具特色的信号放大方式提高了miRNA检测时的灵敏度，AuNPs由于其易和蛋白以及DNA等共价结合等性质，也已应用于各种传感器中。目前就DNA传感界面的研究来说，DNA四面体纳米结构使探针浓度、在界面的朝向都可以做到可控，且使探针在传感界面的分布要更均一，因此传感器能具有更高灵敏度和特异性，目前仅在金电极上有所应用，研究者们可以在其他更廉价的电极（例如碳电极）上对DNA四面体进行尝试，以便拓宽DNA四面体在生物传感中的应用。电化学分析方法具有速度快、选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低且易于微型化等优点，是一种非常适用于医院的疾病预测及诊断的方法。相比目前医院中所用到的影像学方法，不但极大限度地减小了诊断癌症等疾病时对病人身体的损伤，并且有望用于癌症的早期诊断。电化学产品可以产业化，有望做成廉价的小型POCT产品，服务于家庭用户。利用电化学分析法用于miRNA的临床检测是一种非常有实际应用前景的方法。

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Electrochemical-based biosensors for quantification micro RNA

LI Fuwu WANG Lihua SONG Shiping
(Shanghai Institute of Applied Physics, Chinese Academy of Sciences, Jiading Campus, Shanghai 201800, China)

This review outlines the materials of recognition element， methods of signal amplification， interface regulation of electrode and the potential application of the research area in expression level of miRNA influence by radiation.

MicroRNA， Cancer， Biomarker， Electrochemical， Biosensor

CLC O653

MicroRNA（miRNA）是一种内源性、非编码的具有高度保守性的由大约 23个核糖核苷酸组成的RNA寡聚物，在动物和植物中通过和编码蛋白的基因转录产生的mRNA以碱基互补配对的方式结合，直接对他们的转录后水平进行抑制［1-3］。最早是Lee等［4］在C. elegans处于发育后期的胚胎中发现lin-4 RNA对lin-14蛋白的表达起着一种抑制的作用。在后来的研究中发现miRNA是从染色体中转录出来，为一个大约由 70个核苷酸组成的初级转录产物叫做Pri-miRNA［5］，一个Pri-miRNA分子通常包含有几个miRNA的序列。Pri-miRNA通过折叠形成一个发夹结构（含有不能完全互补配对的茎，其长度从几百到几千个碱基不等），进而被RNase III型内切酶 Drosha和 Dicer切割成大约 70 bp的Pre-miRNA，而后被Exprotin5蛋白运出细胞核之后被细胞质中的Dicer切割产生大约20 bp的miRNA双螺旋，解旋后其中一条就成为具有抑制基因表达功能的miRNA，另外一条则被降解，偶尔也会有变成两条miRNA的情况［6］。miRNA的作用方式是通过与mRNA的3'末端非转录的区域结合，在转录后水平调节基因的表达［3］。如果一个miRNA和靶标mRNA上的序列不能完全互补，则抑制该 mRNA的翻译过程。若完全互补，则该条mRNA将会被降解（见图1）。根据miRNA在细胞内的通路，可以以不同阶段的miRNA为靶向，设计不同的探针就可以对细胞内各个阶段的miRNA进行定量检测。

LI Fuwu （male） was born in March 1991 and received his master degree from Shanghai Institute of Applied Physics，

21 March 2016； accepted 21 April 2016

Ph.D. SONG Shiping， professor， E-mail: spsong@sinap.ac.cn

O653

10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.030101

国家重大科学研究计划（2012CB932600、2013CB932800）资助

李甫梧，男，1991年3月出生，2016年6月于中国科学院上海应用物理研究所获理学硕士学位，生物物理专业，E-mail: fw lisinap@163.com

宋世平，博士，研究员，E-mail: spsong@sinap.ac.cn

初稿2016-03-21，修回2016-04-21

Supported by the National Basic Research Program of China （2012CB932600， 2013CB932800）

Chinese Academy of Sciences in June 2016， majoring in biophysics. E-mail: fw lisinap@163.com