骨髓间充质干细胞联合EPO对急性脊髓损伤大鼠神经运动功能的影响及机制探讨

余化龙，何宁，刘志刚，熊敏

(湖北医药学院附属东风医院,湖北十堰442008)



骨髓间充质干细胞联合EPO对急性脊髓损伤大鼠神经运动功能的影响及机制探讨

余化龙，何宁，刘志刚，熊敏

(湖北医药学院附属东风医院,湖北十堰442008)

目的观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)联合促红细胞生成素(EPO)治疗急性脊髓损伤的效果，并探讨其作用机制。方法采用脑红蛋白(Ngb)基因重组绿色荧光蛋白-腺病毒载体转染BMSCs，构建Ngb基因修饰的BMSCs。取成年雄性SD大鼠80只制作脊髓损伤模型，分为联合组、EPO组、BMSCs组、对照组各20只，联合组于造模前1 d予5 000 U/kg EPO腹腔注射，造模后于受损脊髓中点及受损中点上下5 mm注入Ngb基因转染的BMSCs各5 μL；EPO组于造模前1 d腹腔注射5 000 U/kg EPO，造模后于脊髓中注入等量不含细胞的培养基；BMSCs组于造模前1 d腹腔注射等量生理盐水，造模后脊髓注入等量Ngb基因转染BMSCs；对照组仅在脊髓损伤前1 d经腹腔注射等量生理盐水，造模后在受损脊髓中注射等量不含细胞培养基。分别于干预1、3、7、14、21 d，采用BBB评分法评价各组神经运动功能，采用BCA蛋白定量试剂盒检测脊髓Ngb 蛋白表达。结果干预1、3、7、14、21 d联合组BBB评分均高于EPO组、BMSCs组、对照组，P均<0.05；干预1、3、7、14、21 d联合组Ngb相对表达量均高于EPO组、BMSCs组、对照组，P均<0.05；干预3、7、14、21 d BMSCs组Ngb相对表达量均高于EPO组、BMSCs组、对照组，P均<0.05；干预3、7、14、21 d EPO组Ngb相对表达量均高于对照组，P均<0.05。结论 Ngb基因修饰的BMSCs联合EPO可明显提高急性脊髓损伤大鼠的神经运动功能，可能与促进Ngb表达有关。

骨髓基质干细胞；促红细胞生成素；脊髓损伤；脑红蛋白

脊髓损伤是临床常见的神经损伤，致残率和致死率均较高[1, 2]。其预后较差，多数患者的运动、感觉恢复情况均不理想。因此，寻求一种较好的恢复脊髓功能的治疗手段是目前的研究热点。近年来，细胞移植以及基因治疗为脊髓损伤的治疗提供了新思路[3]。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是具有多向分化潜能的干细胞，可分泌促进神经生长的因子，促进脊髓损伤的修复[4]。脑红蛋白(Ngb)是人们发现的第3种携氧球蛋白，主要定位于神经元的细胞质[5]，可作为内源性神经保护因子。既往研究发现，Ngb基因修饰的BMSCs可促进中枢神经系统的损伤恢复[6, 7]。促红细胞生成素(EPO)是一种神经营养因子，目前常用于脊髓损伤的治疗[8]。2015年6～12月，我们观察了Ngb基因修饰的BMSCs联合EPO对急性脊髓损伤大鼠神经运动功能的影响，并探讨其作用机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料大鼠BMSCs由本实验室分离与培养。成年SD大鼠80只，体质量220～240(225±8)g，由湖北医药学院实验动物中心提供。293细胞常规培养于湖北医药学院分子生物学中心实验室。Ad-GFP质粒购买于Invitrigen公司，CO2细胞培养箱(Heraeus，德国)，倒置相差显微镜(Olympus,日本)，低温离心机(Heraeus,德国)，胎牛血清(Gibco)，TRIzol(Invitrogen,美国)，SYBR Green Realtime PCR Master Mix (Toyobo Co Ltd,日本)，ReverTra Ace qPCR逆转录试剂盒(Toyobo Co. Ltd,日本)，Hanks(自制)，大鼠淋巴细胞分离液(天津灏洋生物技术公司),β-actin (1∶1 000，Santa Cruz,美国), Ngb(1∶1 000，Santa Cruz,美国)，RIPA蛋白提取液(博士德，武汉)，BCA蛋白定量试剂盒(博士德，武汉)。

1.2Ngb基因修饰的BMSCs构建采用Ngb基因重组绿色荧光蛋白-腺病毒载体(Ad-GFP)转染BMSCs构建Ngb基因修饰的BMSCs。Ad-GFP质粒PacⅠ线性化后LipofectamineTM2000转染293细胞，7～10 d后收集细胞。-70 ℃、37 ℃反复冻融，离心收集上清，获取初毒，同法进行大量扩增。氯化铯纯化病毒，倍比稀释法检测病毒滴度(PFU)。取3次传代的BMSCs按1×105/孔接种于24孔板中，培养24 h后吸出培养液。以最佳MOI值的Ngb重组慢病毒，按不同MOI值加入pAdEasy-GFPCXCRGFP Ngb病毒液，于37 ℃、95%饱和湿度、5%CO2孵箱内培养。感染后每天用荧光显微镜观察荧光表达情况，随机取5 个200 倍视野，计数绿色荧光表达细胞的百分数，求其平均值为感染率。每一MOI 值测3个感染率，计算细胞感染率在80%以上时需要的病毒量来确定最适感染MOI 值。感染BMSCs，并制备浓度为1×106/mL的BMSCs悬液，备用。

1.3 模型构建及分组干预取成年雄性SD大鼠80只，麻醉后仰卧位固定。在T10椎板水平附近消毒上下各5 cm，逐层分离皮肤、皮下脂肪以及椎旁肌肉；用咬骨钳将棘突和终板去除暴露脊髓，用脊髓损伤打击器造成脊髓损伤模型[9]。以大鼠脊髓出血水肿、后肢出现迟缓性瘫痪和尾巴痉挛性摆动为造模成功。逐层缝合伤口后给予青霉素预防感染，分笼饲养，80只大鼠均造模成功。根据随机数字表法将大鼠分为联合组、EPO组、BMSCs组、对照组各20只，联合组于造模前1 d予5 000 U/kg EPO腹腔注射，造模后于受损脊髓中点及受损中点上下5 mm注入Ngb基因转染的BMSCs各5 μL；EPO组于造模前1 d腹腔注射5 000 U/kg EPO，造模后于脊髓中注入等量不含细胞的培养基；BMSCs组于造模前1 d腹腔注射等量生理盐水，造模后脊髓注入等量Ngb基因转染BMSCs；对照组仅在脊髓损伤前1 d经腹腔注射等量的生理盐水，造模后在受损脊髓中注入等量不含细胞培养基。

1.4大鼠神经运动功能评价分别于干预后1、3、7、14、21 d每组各取4只大鼠，膀胱排空后置于直径 1 m的光滑平面自由活动5 min。采用BBB评分量表评价各组大鼠神经运动功能，评分越高说明神经运动功能恢复越好。

1.5脊髓Ngb 蛋白检测取1.5中各时段大鼠，断头处死后取脊髓备用。使用RIPA蛋白提取液提取脊髓总蛋白，SDS-PAGE电泳；5%去脂奶粉封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，一抗分别为β-actin、Ngb；用辣根过氧化物酶共轭的二抗室温孵育2 h，使用BCA蛋白定量试剂盒对提取的蛋白进行定量。所有操作严格按照使用说明书进行。

2　结果

2.1各组BBB评分比较见表1。

2.2各组Ngb蛋白相对表达量比较见表2。

表1　干预1、3、7、14、21 d各组BBB评分比较

注：与EPO组、BMSCs组、对照组比较，*P<0.05。

表2　干预1、3、7、14、21 d各组Ngb 蛋白表达量比较

注：与EPO组、BMSCs组、对照组比较，*P<0.05；与EPO组、对照组比较，△P<0.05；与对照组比较，#P<0.05。

3　讨论

脊髓损伤是脊柱外伤最严重的并发症，往往导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍。脊髓损伤不仅会给患者本人带来身体和心理的严重伤害，还会对整个社会造成巨大的经济负担。脊髓组织的直接机械损伤通常会导致部分或全部的神经功能丧失，如感觉麻痹或运动功能丧失。统计数据显示，车祸伤、高处坠落伤以及暴力事件是脊髓损伤的最常见诱因，分别占36.5%、28.5%和14.3%[10,11]。由于神经元细胞是不可再生细胞，故针对脊髓损伤的治疗一直未取得突破性进展。目前,脊髓损伤的治疗主要集中在急性反应期针对炎症反应避免神经元轴突的二次损伤，以及损伤后针对神经的再生和修复[12, 13]。随着基因治疗和细胞移植的发展，寻找有效的目的基因是人们研究的热点。Ngb是人体内第3种携氧球蛋白，分子量为17 kD，因其主要在脑组织中表达而得名，定位于神经元的细胞质。近年来在脑损伤的研究中发现,Ngb是神经系统特异性携氧珠蛋白及信号转导的调控因子,可作为内源性神经保护因子，对脑缺血缺氧性损伤、创伤性颅脑损伤等中枢神经系统损伤有很好的神经保护作用，外源性Ngb 也具有神经保护作用。

本研究发现，干预1 d联合组BBB评分均高于EPO组、BMSCs组、对照组，原因可能是在脊髓损伤早期Ngb可以发挥内源性保护神经的作用。干预1、3、7、14、21 d联合组Ngb相对表达量均高于EPO组、BMSCs组、对照组，干预3、7、14、21 d BMSCs组Ngb相对表达量均高于EPO组、BMSCs组、对照组，干预3、7、14、21 d EPO组Ngb蛋白相对表达量均高于对照组。通过对各组BBB评分，我们发现在脊髓损伤早期(干预1 d)，各组治疗除联合组与对照组比较差异有统计学意义外，余各组与对照组比较差异均无统计学意义。Antao等[14]通过研究发现，增加神经细胞内Ngb表达可以减轻细胞损伤后继发的线粒体异常，抑制线粒体途径引起的细胞凋亡，从而提高神经细胞的存活率。而当脊髓损伤后，携带Ngb基因的BMSC可以定向归巢到损伤部位，持续分泌Ngb，对损伤神经进行再生修复，而EPO可以促进损伤处血管再生，为BMSCs的归巢和发挥作用提供了路径。这可能是联合治疗优于单独治疗的原因之一。病毒转染Ngb基因的BMSCs可以高水平的分泌Ngb蛋白，在急性脊髓损伤组织中发挥内源性保护作用。研究发现，内源性的Ngb基因对于创伤性颅脑损伤以及缺血缺氧性神经功能的恢复发挥了重要作用。有研究证实，在颅脑损伤后Ngb表达量会增加，而且表达量与时间成正比;EPO治疗并不会增加Ngb表达，EPO治疗急性脊髓损伤的机制可能是EPO仅单纯修复损伤血管，降低炎症反应程度，这也可能是其效果有限的原因。除此之外，有研究证实BMSCs对急性脊髓损伤后活性氧的清除有疗效，这也是其发挥作用的原因之一[15]。通过清除活性氧，抑制氧化应激反应，进而发挥对神经细胞的保护作用。综上所述，Ngb基因修饰的BMSCs联合EPO可明显提高急性脊髓损伤大鼠的神经运动功能，可能与促进Ngb表达有关。

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熊敏(E-mail： xiongmin1964@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.012

R651.2

A

1002-266X(2016)18-0037-03

2015-12-30)