汉防己甲素衍生物P-42对人乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨

晏文涛，潘卫东，刘柏岑，吴翱兰，刘金河，刘杰麟

(贵州医科大学,贵阳550025)



·论著·

汉防己甲素衍生物P-42对人乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨

晏文涛，潘卫东，刘柏岑，吴翱兰，刘金河，刘杰麟

(贵州医科大学,贵阳550025)

目的观察汉防己甲素(TET)衍生物P-42对人乳腺癌细胞株MDA-MB-435增殖、凋亡的影响，并探讨其机制。方法收集对数生长期MDA-MB-435细胞，观察组分别加入不同浓度P-42，空白对照组加入DMEM培养液，培养24 h后，采用MTT法测算细胞增殖抑制率，流式细胞仪检测细胞凋亡率。收集对数生长期MDA-MB-435细胞，观察组分别加入终浓度2、10 μmmol/L的P-42，对照组加入DMEM培养液，另设正常乳腺细胞MCF-10a为空白组，采用Western blot法检测各组细胞布卢姆综合征(BLM)蛋白。结果当P-42 浓度在5、20、80 μmmol/L时，MDA-MB-435细胞增殖抑制率分别为76.00%、84.77%和85.53%，20、80 μmmol/L时细胞增殖抑制率均高于5 μmmol/L时，P均<0.05；80 μmmol/L时细胞增殖抑制率高于20 μmmol/L时，但差异无统计学意义。观察组P-42 浓度在 2、10 μmmol/L时，细胞早期凋亡率分别为39.47%、87.95%，晚期凋亡率分别为2.73%、3.82%，对照组分别为1.40%、0.90%，组间比较，P均<0.05。观察组P-42 浓度在 2、10 μmmol/L时， BLM蛋白的相对表达量为31.57±7.80、33.82±8.61，对照组和空白组BLM蛋白相对表达量分别为12.73±1.14、19.12±1.58，组间比较，P均<0.05。 结论TET衍生物P-42可抑制MDA-MB-435细胞增殖，诱导细胞凋亡，其机制可能与促进BLM蛋白表达有关。

汉防己甲素；乳腺癌；细胞增殖；细胞凋亡；布卢姆综合征基因

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，病死率较高[1]。细胞增殖与凋亡的失衡在乳腺癌的发生发展中起重要作用[2]。布卢姆综合征(BLM)基因是Recq DNA解螺旋酶家族成员之一，其缺乏或突变可导致细胞发生癌变或凋亡[3]。汉防己甲素(TET)是一种提取自防己科植物粉防己根部的中药成分[4]，属于双苄基异喹啉类生物碱，具有止痛、抗高血压、抗风湿、抗炎症和抗肿瘤等效果;TET有多种衍生物，如P-36、P-39、P-40、P-41、P-42、P-44、P-47、P-49、P-51、P-53。本课题组前期研究发现P-42抗肿瘤活性较好，但其具体机制尚不明确。2015年5～12月，我们观察了P-42对人乳腺癌细胞株MDA-MB-435增殖及凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料MDA-MB-435细胞来自贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心细胞库，培养条件：高糖DMEM基础培养基加入10%胎牛血清(FBS)、1%青-链霉素、0.2 mol/L谷氨酰胺和0.2 U/mL的胰岛素。P-42由贵州省中科院天然药物化学重点实验室提供；高糖DMEM培养基、DMEM/F12(1∶1)培养基、0.25%胰蛋白酶、青-链霉素(Hyclone)；FBS(杭州四季青)、Annexin Ⅴ-FITC/PI双染凋亡检测试剂盒(上海贝博)；RIPA强裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(江苏碧云天)，兔抗人BLM多克隆抗体和HRP偶联山羊抗兔IgG(北京中杉金桥)；美国BioTek公司ELx800通用酶标仪、Beckman公司FC500MCL/MPL流式细胞分析仪。

1.2MDA-MB-435培养及传代MDA-MB-435培养条件：高糖DMEM基础培养基加入10%FBS、1%青-链霉素、0.2 mol/L谷氨酰胺和0.2 U/mL的胰岛素。置于5%CO2、37 ℃恒温细胞培养箱中单层传代培养。

1.3MDA-MB-435增殖观察采用MTT法。取对数生长期细胞， PBS洗涤1～2遍，0.25%胰酶消化，10% FBS的培养基终止消化，1 500 r/min离心3 min，8×103/孔接种于96孔板，分为4组，每组6个复孔，分别加入终浓度5、20、80 μmmol/L的P-42干预48 h，另设空白对照组(加入DMEM培养液)。取上清液，加入含MTT 50 μL的培养基，37 ℃孵育4 h，每孔加入150 μL的DMSO，采用全自动酶标仪测定490 nm波长处各孔光密度(OD)值，重复3次，取平均值，计算各组细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(对照组OD值-观察组OD值)/对照组OD值×100%。

1.4MDA-MB-435凋亡观察采用流式细胞仪。取对数生长期细胞接种于96孔板，CO2培养箱中培养24 h，分为2组，每组6个复孔，分别加入终浓度为2、10 μmmol/L P-42干预16 h，同时设立对照组(加入DMEM培养液)，加入 Annexin V-FITC和PI染色，采用流式细胞仪检测各组细胞早期和晚期细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。

1.5BLM蛋白检测 采用Western blot法。取对数生长期细胞，分别用终浓度为2、10 μmmol/L P-42和DMEM培养液(对照组)培养24 h,另设正常乳腺细胞MCF-10a为空白组。PBS洗涤2次，采用BCA试剂盒提取总蛋白， SDS-PAGE电泳，分离，采用半干转膜法将蛋白转印至PVDF膜，将PVDF膜放入含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中，室温封闭2 h；加入一抗，4 ℃孵育过夜，充分洗膜，辣根过氧化物酶标记二抗37 ℃孵育1 h，充分洗膜，ECL显色。结果经成像系统扫描条带，以β-actin为内参，以目的蛋白与内参灰度比值来表示目的蛋白的相对表达量。

2　结果

2.1P-42对MDA-MB-435增殖的影响 当P-42 浓度分别在5、20、80 μmmol/L时，MDA-MB-435细胞增殖抑制率分别76.00%、84.77%和85.53%。P-42浓度为20、80 μmmol/L时细胞增殖抑制率均高于5 μmmol/L时，P均<0.05；20、80 μmmol/L时细胞增殖抑制率间差异无统计学意义。

2.2P-42对MDA-MB-435细胞凋亡的影响观察组P-42 浓度为2、10 μmmol/L时，细胞早期凋亡率分别为39.47%、87.95%，对照组为1.40%，组间比较，P均<0.05。观察组P-42浓度为2、10 μmmol/L时，细胞晚期凋亡率分别为2.73%、3.82%，对照组为0.90%，组间比较，P均<0.05。

2.3P-42对MDA-MB-435中BLM蛋白表达的影响观察组P-42 浓度为2、10 μmmol/L时， BLM蛋白相对表达量分别为31.57±7.80、33.82±8.61，对照组和空白组BLM蛋白相对表达量分别为12.73±1.14、19.12±1.58，组间比较，P均<0.05。

3　讨论

乳腺癌的病因和发病机制目前尚不明确。BLM作为一种解旋酶在维持基因组稳定方面发挥至关重要的作用[3]，主要参与DNA损伤修复、基因重组和染色体错配等。BLM作为一种分子发动机，可以将腺苷三磷酸水解产生的化学能量转化为机械能，进而促使其本身以“蠕动”和“滚动”两种模式沿DNA分子运动，解开双链DNA[5]；其具有3′～5′解旋解链活性，能够解旋多种类型的双链DNA，包括3′末端双链DNA、G-四链体DNA、bubble型DNA、复制叉DNA、D型环状DNA及Holiday结构DNA[6]。BLM是细胞内重要的DNA损伤修复酶，无论是基因复制过程中随机发生的DNA错配，或是机械性、物理性、生物性等因素引起的细胞内DNA错配及损伤[5]，BLM均可通过代偿性增多发挥修复错配及损伤DNA的效应，以维持细胞内正常代谢及功能。

TET作为中国传统的中药有效成分，可用于治疗关节炎、心律不齐、炎症反应、矽肺病、肿瘤等多种疾病[7]，其抗肿瘤机制主要通过介导凋亡[7]、阻断Ca2+通道[8]、引起自噬并调节细胞内活性氧分子[9]等途径抑制和杀伤肿瘤细胞。Bai等[4]研究发现,TET能通过诱导凋亡抑制结肠癌细胞异种移植后的肿瘤生长。Li 等[8]研究表明，TET抗肿瘤效应的一种机制是作为一种非选择性的Ca2+通道阻断剂和Ca2+调节蛋白拮抗剂发挥作用。研究发现，高浓度的TET能诱导肝癌细胞凋亡，低浓度的TET能诱导肝癌细胞自噬，且TET联合其他化疗药物能发挥更明显的抗肿瘤效应[10～12]。本研究结果发现，随P-42浓度升高细胞增殖抑制率逐渐升高。据文献[13,14]报道，顺铂抑制多种肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC50)为10～30 μmmol/L。本实验前期研究中发现P-42对MDA-MB-435的 IC50为2 μmmol/L左右，抑制效果明显优于顺铂。当P-42 浓度在 2、10 μmmol/L时，MDA-MB-435细胞早期凋亡率分别为39.47%、87.95%，对照组早期凋亡率为1.40%，组间比较，P均<0.05。P-42 浓度在 2、10 μmmol/L时，MDA-MB-435晚期期凋亡率分别为2.73%、3.82%，对照组晚期凋亡率为0.90%，组间比较，P均<0.05。由于衍生物P-42的强抑制活性，在2、10、20 μmmol的P-42作用下，细胞均无完整的形态，且大部分细胞已被裂解杀死或呈皱缩形态异；药物作用24 h，细胞在不同药物浓度间活性表现出明显差异，随着药物浓度的增加，细胞死亡数呈增多趋势，差异有统计学意义。本研究结果显示，观察组BLM蛋白的相对表达量高于对照组、空白组。推测可能是由于P-42可穿过细胞膜进入细胞内部引起DNA损伤[15,16]，同时细胞内部启动DNA修复程序，代偿性合成更多DNA修复酶BLM来修复损伤的DNA，以维持基因组稳定和正常核酸代谢[17～19]。

综上所述，TET衍生物P-42可抑制MDA-MB-435的增殖，诱导其凋亡，其机制可能与促进BLM表达有关，但其具体作用机制尚有待于进一步研究。

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Effects of tetrandrine derivatrve P-42 on proliferation and apoptosis of human breast cancer cells and its mechanism

YANWentao,PANWeidong,LIUBocen,WUAolan,LIUJinhe,LIUJielin

(GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China)

ObjectiveTo observe the effects of tetrandrine (TET) derivative P-42 on the proliferation and apoptosis of human breast cancer cell line MDA-MB-435 and to investigate its mechanism.MethodsMDA-MB-435 cells in the logarithmic phase were collected, and then the observation group was treated with different concentrations of P-42, and the control group was added with DMEM nutrient solution. After 24 hours, MTT assay was used to measure the proliferation inhibition rate of MDA-MB-435 cells and flow cytometry was applied to analyze the apoptosis rate. MDA-MB-435 cells in the logarithmic phase were collected, and then the observation group was treated with 2 and 10 μmmol/L P-42, and the control group was added with DMEM nutrient solution, meanwhile, the normal breast cells MCF-10a were taken as the blank group. Bloom syndrome (BLM) protein in each group was detected Western blotting. ResultsWhen the concentrations of P-42 were 5, 20 and 80 μmmol/L, the proliferation inhibition rates of MDA-MB-435 cells were 76.00%, 84.77% and 85.53%, respectively. The proliferation inhibition rates of MDA-MB-435 cells treated with 20 and 80 μmmol/L P-42 were higher than that treated with 5 μmmol/L P-42, allP<0.05. The proliferation inhibition rate of MDA-MB-435 cells treated with 80 μmmol/L P-42 were higher than that treated with 20 μmmol/L P-42, allP<0.05. When the concentrations of P-42 were 2 and 10 μmmol/L, the early apoptosis rates of MDA-MB-435 cells were 39.47% and 87.95%, and that in the control group was 1.4%, allP<0.05. When the concentrations of P-42 were 2 and 10 μmmol/L, the late-stage apoptosis rates of MDA-MB-435 cells were 2.73% and 3.82%, and that in the control group was 0.90%, allP<0.05.When the concentrations of P-42 were 2 and 10 μmmol/L, the relative expression of BLM protein was 31.57±7.80 and 33.82±8.61, and that in the control group and blank group was 12.73±1.14 and 19.12±1.58, allP<0.05.ConclusionTetrandrine derivative P-42 can inhibit the proliferation and induce apoptosis of MDA-MB-435 cells, adn the underlying mechanism may be associated with the up-regulation of BLM expression.

tetrandrine; breast carcinoma; cell proliferation; apoptosis; Bloom syndrome gene

国家自然科学基金资助项目(81360349)。

晏文涛(1989-)，男，硕士，主要研究方向为抗肿瘤药物筛选及抑瘤机制研究。E-mail： 714419389@qq.com

简介：刘杰麟(1963-)，男，博士，教授，主要研究方向为小分子天然活性物质抑制RecQ家族解旋酶等肿瘤相关基因。E-mail：779713773@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.001

R392-33

A

1002-266X(2016)18-0001-04

2016-01-01)