E盒锌指蛋白1反转录本1对人膀胱癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响

王剑锋，李平

(安徽医科大学附属安徽省立医院，合肥230001)



E盒锌指蛋白1反转录本1对人膀胱癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响

王剑锋，李平

(安徽医科大学附属安徽省立医院，合肥230001)

目的研究E盒锌指蛋白1反转录本1(ZEB1-AS1)对人膀胱癌细胞5637增殖、迁移、凋亡的影响。方法取适量对数生长期5637细胞分为观察组和对照组，分别用特异性的阳性对照小干扰RNA ZEB1-AS1、特异的阴性对照小干扰RNA转染细胞，采用实时荧光定量qRT-PCR法观察转染48 h两组细胞ZEB1-AS1 mRNA；采用MTT法观察转染24、48、72 h细胞增殖情况，采用细胞划痕实验观察转染48 h细胞迁移情况，采用流式细胞仪检测转染48 h细胞凋亡情况。结果转染48 h观察组和对照组ZEB1-AS1 mRNA的相对表达量分别为0.525 3±0.043 2、1.000 0±0.020 2，P<0.05；观察组转染24、48、72 h细胞增殖的OD值分别为0.316 4±0.007 8、0.595 4±0.032 5、0.770 3±0.030 7，对照组分别为0.452 9±0.016 1、0.732 6±0.037 0、0.920 4±0.018 9，组间比较P均<0.05；转染48 h时观察组和对照组的细胞迁移距离分别为(0.435±0.005)、(0.680±0.020)cm，P<0.05。转染后48 h观察组和对照组的细胞凋亡指数分别为 15.70±0.94、14.53±0.69，P<0.05。结论ZEB1-AS1可促进人膀胱癌细胞增殖、迁移，抑制细胞凋亡，可能在膀胱癌的发生、发展中起重要作用。

膀胱癌；长链非编码RNA；E盒锌指蛋白1反转录本1；细胞增殖；细胞凋亡；细胞迁移

膀胱癌发病率居泌尿系统恶性肿瘤发病率首位，复发率和晚期病死率均较高，目前尚无有效治疗方法[1～3]，研究其发生机制具有重要临床治疗意义。长链非编码RNA (LncRNA)是一类不翻译和不编码蛋白质的长链RNA[4～6]，可在转录、转录后及表观遗传等阶段调控基因表达，参与物种进化、细胞分化、器官形成、胚胎发育、物质代谢等基础生命活动，在胃癌、乳腺癌和食管癌等人类肿瘤疾病的发生发展中起重要作用[7～12]。E盒锌指蛋白1反转录本1(ZEB1-AS1)是最新发现的一种LncRNA，其异常表达在食管鳞状细胞癌和肝癌中起重要作用[13，14]，但其在膀胱癌中的作用机制尚不明确。2014年4月～2016年1月，我们观察了ZEB1-AS1对人膀胱癌细胞5637增殖、迁移、凋亡的影响。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料5637由安徽省立医院中心实验室惠赠。Lipofectamine2000、TRIzol试剂购自美国Invitrogen 公司，RPMI-1640培养基、谷氨酰氨、青霉素-链霉素混合液胎牛血清(FBS)购自美国Gibco 公司，四甲基偶氮唑盐(MTT) 、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma Aldrich 公司，高速冷冻离心机购自美国Sigma 公司，NanoDrop2000 超微量分光光度计购自美国Thermo Scientific 公司，Thermal Cycler C1000 PCR 仪购自美国Bio-Rad公司，Light Cycler 480Ⅱ 实时荧光定量PCR 仪购自瑞士Roche公司，THZD 型台式恒温振荡器购自江苏省太仓市实验设备厂，DTX880 荧光检测仪购自美国Beckman Coulter 公司。

1.2 细胞分组及转染取适量5637细胞于含10%FBS、1%谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素混合液的完全RPMI-1640培养基培养，37 ℃、5% CO2培养。取对数生长期细胞，接种于96孔板中，分为观察组和对照组，每组6个复孔。待细胞贴壁且融合度达到40%～60%时，观察组和对照组分别用特异性的阳性对照小干扰RNA ZEB1-AS1(si-ZEB1-AS1,5′-CCAUGAAUUCCUUCCUAAA-3′,苏州吉玛基因股份有限公司)、特异的阴性对照小干扰RNA(si-NC,5′-UUUAGGAAGGAAUUCAUGG-3′ ,苏州吉玛基因股份有限公司)，37 ℃孵育6 h，弃转染液，置于10% FBS的正常RPMI-1640培养基继续培养备用。

1.3细胞ZEB1-AS1 mRNA检测采用实时荧光定量qRT-PCR法。取转染48 h 的两组细胞，按照TRIzol 试剂说明书提取总RNA,逆转录合成cDNA，所有操作严格按照使用说明书进行。上下游引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，ZEB1-AS1上游引物：5′-ATTGTTAGGAAAGGTTATAAAATTT-3′，下游引物：5′-ACCCAAACTATATAAAAAATTACAC-3′[13]；GAPDH上游引物：5′-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′，下游引物：5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3′。 反应条件:94 ℃预变性反应30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.4细胞增殖观察采用MTT法。分别取转染24、48、72 h的两组细胞，接种于96 孔中， 每组5个复孔。加入10 μL /孔MTT 溶液，培养4 h后弃培养液；加入DMSO 150 μL/孔，震荡10 min 后，在酶标仪波长490 nm 处检测各孔光密度(OD)值。重复3次，取平均值，以各组OD值代表细胞的增殖情况。

1.5细胞迁移情况观察采用细胞划痕实验。收集转染48 h两组细胞,接种于6孔板，每组6个复孔。细胞融合度90%以上时，转染并继续放置于培养箱培养。用200 μL无菌移液枪头划线,立即在光学显微镜下拍照；更换新鲜的培养基，放置于37 ℃、5%CO2培养24 h后再次拍照。取5个视野，测量划痕两侧细胞间距，取平均值，重复3次，以划痕两侧细胞间距平均值代表细胞迁移情况。

1.6细胞凋亡观察采用流式细胞仪。取转染后48 h对数生长期细胞，消化收集细胞并洗涤，然后重悬于200 μL的结合缓冲液。加入10 μL AnnexinV-FTC 和5 μL PI后轻轻混匀，避光并室温反应15 min；加入300 μL结合缓冲液，用流式细胞仪检测细胞凋亡数目，计算细胞凋亡指数。凋亡指数=凋亡细胞数/总细胞数×100。

2　结果

2.1两组细胞ZEB1-AS1 mRNA相对表达量比较转染48 h观察组和对照组ZEB1-AS1 mRNA相对表达量分别为0.525 3±0.043 2、1.000 0±0.020 2，P<0.05。

2.2两组细胞增殖情况比较见表1。

2.3两组细胞迁移情况比较转染48 h时观察组和对照组的细胞迁移距离分别为(0.435±0.005)、(0.680±0.020)cm，P<0.05。

2.4两组细胞凋亡指数比较转染48 h观察组和

表1　转染24、48、72 h两组细胞增殖情况比较

注：与对照组比较，#P<0.05。

对照组的细胞凋亡指数分别为15.70±0.94、14.53±0.69，P<0.05。

3　讨论

膀胱癌的发生是多种内外因相互影响导致的复杂病理过程。最新研究发现，膀胱细胞DNA改变的缓慢过程与C-myc、Bcl-2、H-Ras等癌基因的激活和p53、p21、Rb等抑癌基因的失活密切相关[15]，但具体发病机制至今仍不明确。近年研究发现，LncRNA的异常表达与肿瘤疾病的发生发展以及预后密切相关[4～7],对于这种在癌症中异常表达的LncRNA的功能和机制仍有待进一步研究探索。文献报道，许多LncRNA在在肿瘤发生发展起着癌基因调控作用[7,9,12]，因此异常表达的LncRNA将有助于肿瘤的诊断治疗以及预后指导。研究发现,PVT1、UCA 以及SPRY4-IT1等LncRNA在膀胱癌的发生发展中起着癌基因的作用[7,16]。

ZEB1-AS1是LncRNA家族中的一员,其是胚胎发育、细胞分化、肿瘤的发生发展等生理病理过程必不可少的转录因子。ZEB1-AS1的表达水平与食管癌的发生、发展及预测患者预后密切相关[9]；过表达的ZEB1-AS1可促进肝癌的转移，预测患者预后。因此，推测ZEB1-AS1可能对膀胱恶性肿瘤有类似的作用。本课题组前期研究发现，膀胱癌组织中ZEB1-AS1表达高于癌旁正常组织。本研究发现，转染48 h观察组ZEB1-AS1 mRNA的相对表达量低于对照组，转染24、48、72 h观察组细胞增殖的OD值均低于对照组，转染48 h时观察组的细胞迁移距离低于对照组，细胞凋亡指数高于对照组，说明ZEB1-AS1可促进5637细胞增殖、迁移，抑制细胞凋亡，推测其可能作用机制为：①ZEB1-AS1可作为膀胱癌癌基因直接参与膀胱癌的基因调控，促进膀胱癌细胞的增殖；②ZEB1-AS1可通过调节上皮细胞间质转型参与膀胱癌的发生，促进膀胱癌细胞增殖、迁移，抑制凋亡[13]；③通过激活癌基因或者抑制抑癌癌基因，间接促进膀胱癌的增殖、迁移以及抑制凋亡[14]。

综上所述，ZEB1-AS1的表达与人膀胱癌细胞的增殖、迁移、凋亡密切相关，其可能是一种发挥正调控作用的癌基因。本研究对提高膀胱癌的早期诊断及基因靶向治疗有重要的指导意义。后续将进一步研究ZEB1-AS1在膀胱癌发生、发展中的具体作用机制。

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Effects of ZEB1-AS1 on proliferation, migration and apoptosis of bladder cancer cells

WANGJianfeng,LIPing

(AnhuiProvincialHospital,Hefei230001,China)

ObjectiveTo study the effects of zinc E box 1 antisense 1 (ZEB1-AS1) on proliferation, migration and apoptosis of human bladder cancer 5637 cell line (5637 for short as follow). MethodsWe took suitable amount of 5637 cells in logarithmic phase and divided them into the observation group and control group, which were respectively transfected with the specific positive control small interference RNA ZEB1-AS1 (si-ZEB1-AS1) and the specific negative control small interference RNA (si-NC). The real-time qRT-PCR was used to detect ZEB1-AS1 mRNA after 48-hour transfection. MTT assay was used to detect the cell proliferation at 24, 48, 72 h after transfection, scratch assay was used to detect the cell migration at 48 h after transfection, and flow cytometry was used to detect the apoptosis at 48 h after transfection. ResultsAfter 48-hour transfection, the relative expression of ZEB1-AS1 mRNA in the observation group and control group was respectively 0.525 3±0.043 2 and 1.000 0±0.020 2,P<0.05; the OD values of the observation group at 24, 48 and 72 h after transfection were respectively 0.316 4±0.007 8, 0.595 4±0.032 5 and 0.770 3±0.030 7, and those in the control group were respectively 0.452 9±0.016 1, 0.732 6±0.037 0 and 0.920 4±0.018 9, allP<0.05. The cell migration distance after 48-hour transfection in the observation group and control group were respectively (0.435±0.005) and (0.680±0.020) cm,P<0.05. After 48-hour transfection, the cell apoptosis index in the observation group and control group were respectively 15.70± 0.94 and 14.53±0.69,P<0.05.ConclusionZEB1-AS1 can promote the cell proliferation, migration, and inhibit apoptosis of human urinary bladder cancer cells, which may play an important role in the occurrence and development of bladder cancer.

urinary bladder carcinoma; long non-coding RNA; zinc E box 1 antisense 1; cell proliferation; apoptosis; cell migration

国家中医药管理局中医肿瘤病学重点学科经费资助[国中医药发(2009)30号]。

王剑锋(1987-)，男，硕士研究生在读，主要研究方向为老年肿瘤的中西医结合治疗。E-mail： 754559269@qq.com

简介：李平(1964-)，男，教授，主任医师，硕士生导师，主要研究方向为老年肿瘤的中西医结合治疗。E-mail： 754559269@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.005

R737.14

A

1002-266X(2016)18-0015-03

2016-01-22)