水飞蓟宾对巨噬细胞摄取氧化低密度脂蛋白的影响*

李秀英，叶云（西南医科大学附属医院药学部，四川泸州646000）

·论著·

水飞蓟宾对巨噬细胞摄取氧化低密度脂蛋白的影响*

李秀英，叶云△
（西南医科大学附属医院药学部，四川泸州646000）

目的探讨水飞蓟宾对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响及相关机制。方法以RAW264.7巨噬细胞为细胞模型，采用MTT法检测水飞蓟宾对巨噬细胞活性的影响；油红O染色观察水飞蓟宾对巨噬细胞摄取氧化低密度脂蛋白（oxLDL）的影响；Western blotting检测水飞蓟宾对巨噬细胞SR-A、CD36、c-fos、c-Jun蛋白表达的影响及c-Jun N端激酶抑制剂SP600125对水飞蓟宾减少巨噬细胞CD36蛋白表达的影响。采用SPSS10.0统计软件进行数据分析，并采用双尾t检验进行统计学意义评估。结果12.5、25.0、50.0μg/mL水飞蓟宾对巨噬细胞活性无影响；50.0μg/mL水飞蓟宾显著抑制巨噬细胞对oxLDL的摄取［抑制率为（80.0±1.8）%］，从而减少巨噬细胞源性泡沫细胞的形成；12.5、25.0、50.0μg/mL的水飞蓟宾剂量依赖性降低巨噬细胞CD36蛋白表达，12.5、25.0、50.0μg/mL的水飞蓟宾组CD36蛋白量为对照组的（0.60±0.06）、（0.45±0.07）、（0.10±0.06）倍，差异均有统计学意义（P＜0.05），但对SR-A蛋白表达无影响；水飞蓟宾剂量依赖性降低细胞核c-fos蛋白量，12.5、25.0、50.0μg/mL水飞蓟宾组细胞核c-fos蛋白量是对照组的（0.50±0.05）、（0.40±0.06）、（0.30±0.05）倍，差异均有统计学意义（P＜0.05）；SP600125与水飞蓟宾共同孵育巨噬细胞后，CD36蛋白量降低为对照组的（0.20±0.06）倍，与水飞蓟宾处理组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论水飞蓟宾可抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成，且与抑制c-fos/CD36通路相关。

动脉粥样硬化；巨噬细胞；泡沫细胞；脂蛋白类，LDL；水飞蓟素

【Abstract】Objective To explore the effectsof Silibinin onmacrophage-derived foam cell formation and itsmechanisms. M ethods RAW 264.7 macrophagewas used as the cellmodel，the effectsof Silibinin on themacrophage viabilitywas examined by MTT；the oil-red O staining was used to observe the effects of Silibinin on the uptake of oxidized low density lipoprotein （oxLDL）inmacrophages；the effectsofSilibinin on SR-A，CD36，c-fos，c-Jun protein expression inmacrophages，and c-Jun N-terminalkinase inhibitor SP600125 on reduction of CD protein expression inmacroph ages were detected by using Western blotting. The datawere analyzed by using the SPSS10.0 statistical soft ware and the statistical significance was assessed by the two-tailed t test.Results 12.5，25.0，50.0μg/mL Silibinin had no effecton macrophage viability；50μg/mL Silibinin significantly inhibited the oxLDL up take by macrophages［inhibition rate of（80.0±1.8）%］，thus reduced the macrophage-derived foam cell for mation；12.5，25.0，50.0μg/mLSilibinin decreased themacrophage CD36 protein expression in a dose dependentmanner，the CD36 protein levels in 12.5，25.0，50.0μg/mLSilibinin groupswere（0.60±0.06），（0.45±0.07），（0.10±0.06）fold of the control group，the differences were statistically significant（P＜0.05），but with out affecting the SR-A protein expression inmacrophages；Silibinin decreased nuclear c-fos protein in a dose dependentmanner，the nuclear c-fos protein levels in 12.5，25.0，50.0μg/mL Silibinin groups were（0.50±0.05），（0.40±0.06），（0.30±0.05）fold of the controlgroup，the differences were statistically significant（P＜0.05）；after the co-incubation with macrophagesby SP 600125 and Silibinin，the CD36 protein levelwas further decreased to（0.20±0.06）times of the control group，compared with the Silibinin-treated group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion Silibinin could inhibit the formation of macrophage-derived foam cells，moreover which is possibly related with the inhibition ofc-fos/CD36 pathway.

【Key words】A therosclerosis；M acrophages；F oam cells；Lipoproteins，LDL；Silymarin

动脉粥样硬化是以动脉壁脂质聚集或炎症发生为特征的慢性疾病，是不稳定性心绞痛、心肌梗死的主要原因［1］。巨噬细胞源性泡沫细胞在动脉粥样硬化的发生发展中起着重要的作用。对氧化低密度脂蛋白（oxLDL）无限制的摄取是巨噬细胞成为泡沫细胞的重要原因［2］。清道夫受体SR-A及CD36是巨噬细胞摄取oxLDL的主要受体［3］。有研究显示，减少SR-A、CD36的表达可以抑制泡沫细胞的形成并最终延缓动脉粥样硬化的发生发展［4］。

水飞蓟除了被广泛应用于肝脏疾病的治疗外，对心血管也有保护作用，如水飞蓟可降低高脂动物血浆胆固醇和低密度脂蛋白水平［5］，抑制血管增生［6］，保护内皮细胞［7］，改善脑缺血再灌注损伤的作用［8］。有研究显示，水飞蓟可抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的进展［9］。水飞蓟宾作为水飞蓟最主要的活性成分，其是否能抑制泡沫细胞形成达到抗动脉粥样硬化的作用有待进一步研究。此外，有研究表明，c-Jun、c-fos与巨噬细胞CD36蛋白表达相关［2］。本研究拟从SR-A、CD36、c-Jun、c-fos蛋白表达变化的角度探讨水飞蓟宾对巨噬细胞源性泡沫细胞的影响，为水飞蓟宾抗动脉粥样硬化作用机制的研究和临床应用提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料RAW264.7巨噬细胞由重庆医科大学生命科学院提供；油红O、甘油明胶、水飞蓟宾购自Sigma公司；SR-A、CD36、c-Jun、c-fos、β-actin抗体购于美国Abcam公司；1640培养基、消化胰酶、胎牛血清购自Gibco公司；oxLDL购自广州奕源生物公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养采用含10%胎牛血清的1640培养基置于5%CO2、37℃的培养箱中培养细胞，胰酶消化传代。培养液中加入水飞蓟宾（0.0、12.5、25.0、50.0μg/mL）干预24 h，加入20μLMTT孵育4 h后，加入DMSO 120μL震荡10min，在波长570 nm处检测吸光度A570。

1.2.2油红O染色将RAW264.7巨噬细胞接种于6孔板内，细胞孵育24 h结束后，吸弃上清液，10%多聚甲醛固定30min，PBS轻轻洗1次后，油红O染色10min，再用60%异丙醇洗细胞1次（孵育时间10 s），吸弃异丙醇，PBS清洗1次后显微镜下照相。

1.2.3Western blotting检测相关蛋白的表达经过水飞蓟宾（0.0、12.5、25.0、50.0μg/mL）处理24 h，或c-Jun N端激酶抑制剂SP600125（10μm）孵育1 h后，再用25.0 ug/mL水飞蓟宾孵育24 h，收集细胞，加入细胞裂解液裂解细胞并提取蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。25μg蛋白样品与上样缓冲液混合后煮沸10min，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（100 V，恒压2 h），湿转（300mA，恒流1.5 h），5%脱脂奶粉封膜1 h，PBST漂洗3次后分别加入一抗和β-actin 4℃孵育过夜，PBST漂洗3次，37℃二抗（1∶1 000稀释）反应1 h后进行ECL显色。以β-actin作为内参，计算目的蛋白的表达情况。

1.3统计学处理应用SPSS10.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用双尾t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1水飞蓟宾对RAW264.7巨噬细胞活性的影响不同浓度的水飞蓟宾（0.0、12.5、25.0、50.0μg/mL）孵育巨噬细胞24 h后，采用MTT法检测细胞活性，A570值分别为3.70±0.03、3.69±0.05、3.68±0.07、3.68±0.06，水飞蓟宾处理组与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见图1，12.5、25.0、50.0μg/mL水飞蓟宾对RAW264.7细胞活性无影响。

2.2水飞蓟宾对巨噬细胞源性的泡沫细胞形成的影响

由图2可知，对照组细胞内聚集的脂质较少，oxLDL处理组细胞内脂质明显增多，油红O染色后阳性细胞数增加了（3.00±0.05）倍，与oxLDL组比较，水飞蓟宾处理组（50μg/mL）细胞内脂质聚集显著减少，油红O染色后阳性细胞数减少了（80.00±1.80）%。结果表明水飞蓟宾可以抑制巨噬细胞对oxLDL摄取，从而减少泡沫细胞的形成。

图1　水飞蓟宾对巨噬细胞活性的影响

图2　水飞蓟宾对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响（油红O染色，400×）

2.3水飞蓟宾对巨噬细胞膜蛋白SR-A、CD36蛋白表达的影响如图3所示，水飞蓟宾剂量依赖性降低巨噬细胞CD36蛋白的表达，12.5、25.0、50.0μg/mL水飞蓟宾组CD36蛋白量是对照组的（0.60±0.06）、（0.45±0.07）、（0.10±0.06）倍，差异均有统计学意义（P＜0.05）；12.5、25.0、50.0μg/mL水飞蓟宾组SR-A蛋白量是对照组的（0.98±0.07）、（0.97±0.06）、（0.96±0.05）倍，但差异均无统计学意义（P＞0.05），表明水飞蓟宾可能通过抑制CD36蛋白表达，从而抑制巨噬细胞对oxLDL的摄取。

2.4水飞蓟宾对细胞核c-Jun、c-fos蛋白表达的影响如图4所示，水飞蓟宾剂量依赖性降低细胞核c-fos蛋白量，12.5、25.0、50.0μg/mL水飞蓟宾组细胞核c-fos蛋白量是对照组的（0.50±0.05）、（0.40±0.06）、（0.30±0.05）倍，差异有统计学意义（P＜0.05）；12.5、25.0、50.0μg/mL水飞蓟宾组细胞核c-Jun蛋白表达量是对照组的（1.01± 0.06）、（1.00±0.08）、（0.99±0.05）倍，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3　水飞蓟宾对巨噬细胞细胞膜蛋白CD36、SR-A蛋白表达的影响

2.5c-Jun N端激酶抑制剂SP600125对水飞蓟宾减少巨噬细胞CD36蛋白表达的影响如图5所示，c-Jun N端激酶抑制剂SP600125进一步增加水飞蓟宾减少巨噬细胞CD36蛋白表达的作用。25.0μg/mL水飞蓟宾处理细胞后，CD36蛋白量降低为对照组的（0.45±0.07）倍，差异有统计学意义（P＜0.05）；SP600125与水飞蓟宾共同孵育巨噬细胞后，CD36蛋白量降低为对照组的（0.20±0.06）倍，与水飞蓟宾处理组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），图4、5的实验结果表明发现水飞蓟宾可能通过抑制c-fos/CD36通路减少巨噬细胞对oxLDL的摄取。

与对照组比较，aP＜0.05；与水飞蓟宾处理组比较，bP＜0.05。

3　讨论

有研究表明，水飞蓟宾有降血脂、预防动脉粥样硬化的作用［10］。但水飞蓟宾是否减少巨噬细胞内脂质的聚集及相关机制尚未见报道。本研究显示，水飞蓟宾通过减少巨噬细胞清道夫受体CD36的表达抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成。本研究结果表明，水飞蓟宾在动脉粥样硬化区域维持泡沫细胞内脂质处于正常水平有保护作用，并阐明了相应的机制。

清道夫受体介导的巨噬细胞内脂质聚集在泡沫细胞形成过程中起着重要的作用［11］。本研究结果首次证明水飞蓟宾通过减少巨噬细胞对oxLDL的摄取，从而抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成。此外，水飞蓟宾显著降低巨噬细胞CD36蛋白的表达，但是对SR-A蛋白的表达无影响。清道夫受体CD36和SR-A是巨噬细胞摄取oxLDL的主要受体［3］。研究表明，从基因水平上灭活CD36后，在体外，巨噬细胞摄取的oxLDL减少，在体内，ApoE-/-小鼠动脉粥样斑块区域减少。且大量研究显示，抗动脉粥样硬化的抗氧化药物能有效降低CD36的表达，表明CD36与动脉粥样硬化的发生相关［12-14］。本研究结果显示，水飞蓟宾通过抑制巨噬细胞CD36蛋白的表达，抑制巨噬细胞对oxLDL的摄取，且与水飞蓟宾减少巨噬细胞细胞核c-fos蛋白量有关。事实上，c-Jun N端激酶抑制剂SP600125增加了水飞蓟宾对CD36蛋白表达的抑制作用。本研究结果表明，水飞蓟宾抑制泡沫细胞形成需要灭活c-fos通路。水飞蓟宾具有减少CD36蛋白表达与减少巨噬细胞摄取oxLDL的功能，最终抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成有关。

总之，本研究结果表明，水飞蓟宾通过抑制巨噬细胞细胞核c-fos蛋白量，减少清道夫受体CD36蛋白的表达，从而减少巨噬细胞对oxLDL的摄取，最终抑制泡沫细胞的形成。本研究提供了水飞蓟宾抗动脉粥样硬化的新机制，同时也为抗动脉粥样硬化提供了治疗靶点。

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Effectsof Silibinin on uptake of oxLDL inmacrophages*

LiXiuying，Ye Yun△
（Department of Pharmacy，Affiliated Hospital of Southwest MedicalUniversity，Luzhou，Sichuan 646000，China）

·论著·

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.08.001

A

1009-5519（2016）08-1121-03

国家青年自然科学基金资助项目（81500357）；西南医科大学附属医院课题（15044）；西南医科大学课题（2015-03-10）。

李秀英（1987-），博士研究生，讲师，主要从事动脉粥样硬化发病机制研究。

△，E-mail：yeyun8622@163.com。

（2016-02-21）