多药耐药铜绿假单胞菌耐药表型及分子流行病学调查研究*

宋敏，向成玉，丁银环，杨葵，吴泽才，林雁，刘靳波（西南医科大学附属医院检验科，四川泸州646000）

·论著·

多药耐药铜绿假单胞菌耐药表型及分子流行病学调查研究*

宋敏，向成玉，丁银环，杨葵，吴泽才，林雁，刘靳波△
（西南医科大学附属医院检验科，四川泸州646000）

目的探讨该院多药耐药铜绿假单胞菌（PAE）的耐药表型及其分子流行病学特征，为医院内感染监控和制订感染控制措施提供科学依据。方法收集该院2012年9月至2013年2月临床分离的49株多药耐药PAE，采用MicroScan WalkAway 96SI全自动微生物鉴定/药敏测试系统鉴定菌株并获得对15种抗菌药物药敏结果。利用基因外重复回文序列-聚合酶链反应（REP-PCR）对PAE进行分子分型。结果49株多药耐药PAE，对亚胺培南的耐药率最高，为79.6%；对庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、头孢他啶、头孢曲松钠、头孢噻肟、头孢吡肟、氨曲南、加替沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/甲巯咪唑、替卡西林/克拉维酸的耐药率在38.8%～65.3%。49株PAE的遗传相似性为0.70～1.00，经REP-PCR技术，将49株多药耐药PAE分为4型及9个亚型。结论该院多药耐药PAE耐药严重并存在克隆传播流行，及时实施医院内感染的防控策略，能有效预防多药耐药PAE的暴发和流行。

假单胞菌，铜绿；聚合酶链反应；药物耐受性；交叉感染

【Abstract】Objective To investigate the drug resistance phenotype andmoleculare pidemiology characteristics of multidrug resistant pseudomonas aeruginosa（PAE）to provide the scientific basis for controlling the nosocomial infection and formulating the infection controlmea sures.Methods Forty-nine strains of multi-drug resistantPAE in our hospital from September 2012 to February 2013 were collected and identified by the Micro Scan Walk Away 96 SIautomaticmicrobial identification/susceptibility testsystem.The susceptibility results of PAE to 15 kinds ofantibacterial drugswere obtained at the same time.Finally，PAE was performed the molecular typing by repetitive extragenic palindromic-polymerase chain reaction（REP-PCR）.Results Forty-nine strains of multi-drug resistant PAE had the highest resistance to imipenem（79.6%）；which to gentamicin，amikacin，tobramycin，ceftazidime，ceftriaxone，cefotaxime，cefepime，aztreonam，gatifloxacin，cipr of loxacin，lev of loxacin，piperacillin，piperacillin/me thimazole，ticarcillin/clavulanate was 38.8%-65.3%.Forty-nine isolates of PAE had the genetic similarity of0.70-1.00 and were divided into 4 typesand 9 subtypesby using REP-PCR.Conclusion Multi-drug resistantPAE has serious drug-resistance and the cloned spread exists in our hospital，the timely implementation of hospital infection prevention and control strategies can effectively prevent the outbreaksand prevalence of multi-drug resistant PAE.

【Key words】Pseudomonasaeruginosa；Polymerase chain reaction；Drug tolerance；Cross infection

铜绿假单胞菌（PAE）是引起人类感染的常见条件致病菌之一，可引起皮肤、黏膜、胃肠道、呼吸道等部位的感染，在医院内感染中占了重要地位。2011年卫生部全国细菌耐药监测网统计显示，PAE临床分离率在非发酵菌中位居第一［1］。近年来广谱抗菌药物的大量应用，PAE株耐药情况日趋严峻，常呈现多药耐药，给临床抗感染的治疗带来巨大挑战［2］。本研究对本院临床分离的多药耐药PAE耐药表型和亲缘关系进行研究，旨在实时监控医院内感染，为临床合理使用抗菌药物及制订医院内感染控制措施提供科学依据。

1　材料与方法

1.1菌株来源收集本院2012年9月至2013年2月临床分离的多药耐药PAE 49株。菌株分离于血液、痰、咽拭子、分泌物、尿液等标本，来自呼吸内科、ICU、烧伤科、神经外科、肝胆外科、儿科等科室。质控菌株ATCC 27853 PAE和ATCC25922大肠埃希菌。

1.2方法

1.2.1菌株的鉴定及药敏采用MicroScanWalkAway 96SI全自动微生物鉴定/药敏测试系统鉴定菌株并同时获得对亚胺培南、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、头孢他啶、头孢曲松钠、头孢噻肟、头孢吡肟、氨曲南、加替沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/甲巯咪唑、替卡西林/克拉维酸15种抗菌药物的耐药情况。

1.2.2细菌DNA的提取将冻存于-80℃的PAE株复苏，采用煮沸法提取细菌DNA。即挑取适量菌落于悬浊于500μL蒸馏水中，100℃干浴10min，然后12 000 r/min离心5min，上清液即为DNA，应用核酸测定仪将DNA浓度调为10 ng/μL，-80℃冰箱保存备用。

1.2.3重复回文序列-聚合酶链反应（REP-PCR）扩增所用引物参照Versalovic等［3］即REP：5′-IIIGCGCCGICATCAGGC-3′，5′-ACGTCTTATCAGGCCTAC-3′，优化后的反应体系：Taq DNA酶1.25U，10×Buffer2.5μL，dNTPs 200μmol/L，模板DNA 80 ng，P1、P2引物各1μmol/L，蒸馏水添加至25μL；优化后的扩增参数：95℃预变性3min；90℃变性30 s，45℃退火1min，65℃延伸8min为1个循环，循环次数35次；最后65℃延伸16min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上成像观察，并摄像保存。

1.3数据分析采用Gel-Pro analyzer分析电泳条带图谱，将某条带存在记为1，不存在记为0，构成原始数据矩阵。采用NTSYS 2.1e软件用UPGMA法计算遗传相似系数，进行SAHN聚类分析。

2　结果

2.1PAE对15种抗菌药物的耐药情况49株多药耐药PAE，对亚胺培南的耐药率最高，为79.6%；对庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、头孢他啶、头孢曲松钠、头孢噻肟、头孢吡肟、氨曲南、加替沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林、哌拉西林/甲巯咪唑、替卡西林/克拉维酸的耐药率在38.8%～65.3%，见表1。

表1　49株PAE药敏结果

2.2REP-PCR电泳指纹图谱49株PAE的指纹条带数在5～8条，部分菌株指纹图谱见图1。

图1　REP-PCR扩增部分电泳图

2.3REP-PCR聚类分析结果49株PAE的遗传相似性为0.70～1.00，见图2。49株PAE被分为A、B、C、D四大型，A型包括A1、A2亚型，A1亚型包括1、9、10号菌株，A2亚型包括5、8、49、11、13、16、37、21、33、48号菌株；B型包括B1、B2亚型，B1亚型包括2、23、47号菌株。B2亚型包括3、15、46、39号菌株；C型包括C1、C2亚型，C1亚型包括35号菌株，C2亚型包括41号菌株；D型包括D1、D2、D3亚型，D1亚型包括4号菌株，D2亚型包括17、31、26、30、40、32、18、19、28、25、27、29号菌株，D3亚型包括6、7、44、42、43、34、12、38、14、45、24、22、20、36号菌株。

图2　REP-PCR聚类分析树状图

3　讨论

医院内感染有较高的发病率与病死率，严重威胁着患者的预后和健康。医院内感染的暴发或流行往往是由某种特定细菌引起，多重耐药菌引起的医院内感染日益严重，已成为医院内感染控制领域的难题和焦点［4］。多药耐药PAE是医院内感染常见的致病菌，其耐药率高，耐药机制复杂，易导致交叉感染，常引起医院内感染的暴发与流行［5-7］。通过分子分型可以对特殊菌株引起的医院内感染进行流行病学调查，证实临床和流行病学的假设，还可用以对已确认的暴发流行进行传染源追踪，从而有效预防再次流行。因此，分子分型技术在确定感染病原菌、病原菌的亲缘性、判定感染的暴发、寻找感染源等方面起着重要作用。随着分子生物学技术的发展，特别是PCR技术的迅速发展，出现了一系列基于细菌DNA指纹图谱的分子生物学分型方法。REP-PCR以其操作方便、费用低廉、不需要特殊仪器设备、不需要重复设计引物、分辨率高、重复性和稳定性较好、可以进行大样本分析等优势，便于各层次的医院开展医院内感染控制工作。

本研究49株多药耐药PAE对亚胺培南的耐药率最高（79.6%），对头孢曲松钠、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、环丙沙星、左氧氟沙星、哌拉西林、氨曲南耐药率均在50%以上，以上抗菌药物考虑不作为首选药物进行抗菌治疗。对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、加替沙星、哌拉西林/甲巯咪唑、替卡西林/克拉维酸耐药率在38.8%～46.9%，这几种药物可作为PAE经验治疗选择药物。随着抗菌药物在临床上的广泛应用，多药耐药PAE药株不断增多，其耐药性在不同地区或医院之间存在差异［8］。因此，对本院PAE耐药进行监测，为临床第一时间经验用药提供指导和依据，对合理使用抗菌药物，缓解抗菌药物选择性压力，具有十分重要的意义。

REP-PCR基因分型将49株PAE分成4型和9个亚型，每个亚型内的菌株相似性系数为1，提示各亚型内的菌株可能是同一克隆菌株。查阅临床资料发现，每个亚型内菌株大多是在同一病房或病区在同一时期分离所得，因此可以推断这些克隆菌株多为医院内感染。经回顾性调查分析，11、12号菌株分别于2012年10月5日、2012年10月7日从呼吸内科患者痰和肾病内科患者尿标本中获得，REP-PCR分型结果显示，11、12号菌株分属于A型和D型，说明这2株菌属于不同菌株，临床资料和分型结果相符。23、26号菌株分别于2012年11月19日、2012年11月24日从ICU患者痰和分泌物中获得，虽然这2株菌在同一病房中分离而得，但由于23、26号菌株分别属于B型、D型，应视为不同分型的菌株。42、43、44号菌株，分别于2013年1月3日、2013年1月6日和2013年1月9日从ICU室患者痰和尿，以及呼吸内科患者分泌物分离而得，这些菌株可能来源于同一菌株的克隆流行。值得注意的是，这些克隆菌株可能在科室内部甚至科室之间存在克隆流行，应及时有效地切断病原菌的医院内感染途径，遵守无菌技术操作规程，加强病房的感染管理，增强医务人员手卫生意识，严格实施隔离措施，加强环境清洁和消毒工作等防控措施，从而避免病原菌在医院内感染暴发流行。

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［3］Versalovic J，Koeuth T，Lupski JR.Distribution of repetitiveDNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes［J］. Nucleic AcidsRes，1991，19（24）：6823-6831.

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［8］邓芳，张健，张世勇，等.多重耐药铜绿假单胞菌感染的危险因素及耐药性分析［J］.重庆医学，2013，42（35）：4304-4306.

Survey and research on drug resistance phenotype and molecular epidem iology of multi-drug resistant pseudomonas

aeruginosa*

Song Min，Xiang Chengyu，Ding Yinhuan，Yang Kui，Wu Zecai，Lin Yan，Liu Jinbo△（Department of Clinical Lab-oratory，Affiliated Hospital of South westMedicalUniversity，Luzhou，Sichuan 646000，China）

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.08.006

A

1009-5519（2016）08-1135-03

泸州市人民政府战略合作科技项目（2013CDLZ-S15号）；泸州医学院科学研究资助项目（2013ZRQN034）。

宋敏（1985-），硕士研究生，主要从事临床检验工作。

△，E-mail：lizonglin85@163.com。

（2016-01-17）