酒续断对骨质疏松型大鼠OPG/RANK/RANKL轴系统的调控研究*

2016-09-05陶益陈西任玉超蔡宝昌南京中医药大学药学院江苏南京210023

现代医药卫生 2016年8期

陶益，陈西，任玉超，蔡宝昌（南京中医药大学药学院，江苏南京210023）

陶益，陈西，任玉超，蔡宝昌
（南京中医药大学药学院，江苏南京210023）

目的比较生、酒续断灌胃给药对骨质疏松大鼠骨保护素（OPG）/细胞核因子-κB受体活化因子（RANK）/RANK配体（RANKL）轴的调控差异。方法将30只购于上海杰思捷实验动物有限公司的SPF级SD大鼠通过去势法造成骨质疏松大鼠模型，随机分为正常组、假手术组、模型组、雌二醇组、生续断组和酒续断组，每组5只，灌胃给药12周后，麻醉主动脉取血，采用全自动生化分析仪对给药12周后大鼠血清中钙（Ca）、磷（P）、碱性磷酸酶、骨钙素4项基本指标进行分析，同时使用酶联免疫吸附试验法检测血清OPG、RANK和RANKL 3项骨代谢指标水平，并进行组间对比分析。结果与模型组比较，雌二醇组、生续断组和酒续断组大鼠的碱性磷酸酶、骨钙素和RANKL水平均显著降低，OPG和RANK水平均显著升高，酒续断组大鼠的Ca水平显著降低，P水平升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与雌二醇组比较，生续断组大鼠的碱性磷酸酶和骨钙素水平显著升高，酒续断组大鼠的Ca水平显著降低，P和骨钙素水平显著升高，生续断组和酒续断组大鼠的OPG和RANK水平均显著降低，RANKL水平均显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与生续断组比较，酒续断组大鼠的Ca、碱性磷酸酶、骨钙素及RANKL水平均显著降低，OPG和RANK水平均显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论续断对骨质疏松大鼠的治疗作用与其调控OPG/RANK/RANKL轴有关，酒续断的调控能力强于生续断。

酒炙；续断；骨保护素；Rank配体；骨质疏松；大鼠

【Abstract】Objective To compare the regulation difference of gavage administration of crude and wine-processed Dipsacus on OPG/RANK/RANKL axis in osteoporosis rat.Methods Thirty SPF grade SD rats purchased from the Shanghai Jiesijie Laboratory AnimalCo.，Ltd.were established the osteoporotic modelby the castrationmethod and randomly divided into the normal group，sham operation group，model group，estradiol group，crude Dipsacus group and wine-processed Dipsacus group，5 cases in each group.After 12 weeks of gavage administration，the ratswere anesthetized and aortic blood was collected.The basic biochemical indicators of serum Ca，P，alkaline phosphatase and osteocalcin were analyzed by adopting the automatic biochemical analyzer.Meanwhile，the 3 bonemetabolic indicators of serum OPG，RANK and RANKL levels were determined by using the ELISA method.Results Compared with the model group，the levels of alkaline phosphatase，osteocalcin and RANKL in the estradiolgroup，crude Dipsacus group and wine-processed Dipsacusgroup were significantly reduced，while the levelsofOPG and RANK were significantly increased，the Ca level in the wine-processed Dipsacus group was significantly reduced and the P level was increased，the differences were statistically significant（P＜0.05）；compared with the estradiol group，the levels of alkaline phosphatase and osteocalcin in the crude Dipsacusgroup were significantly increased，whereas the Ca level in thewine-processed Dipsacus group was significantly reduced and the levels of P and osteocalcin were significantly increased，the levels of OPG and RANK in the crude and wine-processed Dipsacus groups were significantly reduced，while the RANKL levelwas significantly elevated，the differenceswere statistically significant（P＜0.05）；compared with the crude Dipsacus group，the levels of Ca，alkaline phosphatase，osteocalcin and RANKL levels in thewine-processed Dipsacus group were significantly reduced，while the levels of OPG and RANK were significantly increased with statistical differences（P＜0.05）.Conclusion The curative effect of Dipsacus in treating osteoporosis rat is related with its regulating the OPG/RANK/RANKL axis.The regulation ability ofwine-processed Dipsacus is stronger than thatofcrude Dipsacus.

【Key words】Wine processing；Dipsacusasper；Osteoprotegerin；Rank ligand；Osteoporosis；Rats

骨质疏松症属于骨代谢性疾病，主要特征是骨量低于正常值和骨质微结构受破坏且变脆，容易导致骨折。随着人口老龄化的加剧，老年骨质疏松症患者持续增加，我国目前有3 500～4 000万骨质疏松患者，女性占2/3，骨质疏松症已经位居中老年人五大疾病患病率之首［1］。中药在治疗骨质疏松症方面疗效显著，如续断皂苷能够显著增加骨质疏松大鼠骨密度，增强骨强度［2］，但续断治疗骨质疏松症的作用机制仍不清楚。现代药理学研究发现，骨保护素（OPG）、细胞核因子-κB受体活化因子（RANK）和RANK配体（RANKL）三者形成的局部调节体系在骨生长和骨重建中起着十分重要的调节作用［3-5］。作者推测续断治疗骨质疏松的作用可能与调控OPG/RANK/ RANKL轴有关。本文首先建立大鼠骨质疏松模型，然后灌胃给予生续断和酒续断水提取液，采用全自动生化分析仪对给药12周后大鼠血清中钙（Ca）、磷（P）、碱性磷酸酶、骨钙素4项基本指标进行分析，同时使用酶联免疫吸附试验（ELISA）对血清中OPG、RANK和RANKL 3项骨代谢指标进行测定，比较生、酒续断给药后相关指标的差异性。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物30只雌性SPF级SD大鼠购于上海杰思捷实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK（沪）2013-0006。通过去势法将30只大鼠造成骨质疏松型大鼠模型，随机分为六组，即正常组、假手术组、模型组、雌二醇组、生续断组和酒续断组，每组5只；大鼠体质量分别为（183.53±4.39）、（186.94±7.66）、（184.52±6.91）、（185.40±8.50）、（183.53±8.28）、（182.99±10.49）g，各组大鼠体质量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.1.2药物与试剂续断药材在四川收集，经南京中医药大学蔡宝昌教授鉴定为川续断科植物川续断（Dipsacusasperoides C.Y.Cheng et T.M.Ai）的干燥根，黄酒购于绍兴女儿红酿酒有限公司，β-雌二醇购于阿拉丁试剂有限公司，ELISA试剂盒购于泉州科诺迪生物科技有限公司。按照《2015版中国药典》要求对续断进行炮制［6］，（1）生续断：取原药材，除去杂质，洗净，润透，切薄片，干燥，得生续断备用；（2）酒续断：取续断片，加黄酒拌匀，每100千克续断片用黄酒10 kg闷透，置炒制容器内，用文火加热，炒至微带黑色，取出，放凉，得酒续断备用。称取续断生品及酒品各50 g，用8倍量纯水加热回流提取2次，每次2 h，合并2次提取液，滤过，倒入蒸发皿上浓缩至100mL，放置于4℃冰箱备用。

1.2方法大鼠适应性饲养7 d后，在无菌条件下，正常组不作处理，假手术组大鼠切除少量腹部脂肪，其余4组大鼠切除双侧卵巢。术后4周开始灌胃，生续断组以生断续1.35g/（kg·d）剂量灌胃；酒续断组以酒断续1.35 g/ （kg·d）剂量灌胃；雌二醇组以雌二醇25μg/（kg·d）灌胃给药（雌二醇难溶于水，以0.5%羧甲基纤维素钠助溶），每天1次；其他组给予相同体积的生理盐水，持续12周。大鼠灌胃给药12周后，禁食，麻醉，抽取腹主动脉血5 mL，经13 000 r/m离心10 min，吸取上清液，存放于-20℃冰箱待测。

1.2.1生化指标分析采用日立全自动生化分析仪对不同组别大鼠血清中Ca、P、碱性磷酸酶、骨钙素4项指标进行测定［7］，并对结果进行统计分析。

1.2.2ELISA法检测血清中OPG、RANK和RANKL水平将样品血清稀释、加样，加酶标抗体，依次加入显色剂、终止液，用酶标仪测量吸光度（OD值）。以标准物浓度和OD值计算出样品水平，再乘以稀释倍数，即为样品的实际水平。

1.3统计学处理应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，各组间指标比较采用ANOVA方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠常规生化指标结果比较与正常组比较，假手术组大鼠血清Ca、P、碱性磷酸酶水平无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05），而骨钙素水平显著升高，且模型组大鼠血清Ca水平显著降低，碱性磷酸酶和骨钙素水平显著升高，雌二醇组、生续断组和酒续断组大鼠血清Ca水平显著降低，血清P水平显著升高，碱性磷酸酶和骨钙素水平显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，雌二醇组、生续断组和酒续断组大鼠的碱性磷酸酶和骨钙素水平显著降低，酒续断组大鼠的Ca水平显著降低，P水平显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与雌二醇组比较，生续断组大鼠的碱性磷酸酶和骨钙素显著升高，酒续断组Ca水平显著降低，P和骨钙素水平显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与生续断组比较，酒续断组大鼠的Ca、碱性磷酸酶和骨钙素水平显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1　各组大鼠血清中Ca、P、碱性磷酸酶和骨钙素水平比较（±s，n=5）

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与雌二醇组比较，cP＜0.05；与生续断组比较，dP＜0.05。

组别正常组假手术组模型组雌二醇组生续断组酒续断组2.54±0.06 2.47±0.05 2.41±0.04a2.42±0.07a2.42±0.06a2.32±0.02abcdCa （mmol/L）1.53±0.11 1.66±0.29 1.74±0.26 1.76±0.15a1.86±0.22a2.02±0.16abc39.25±3.69 39.00±8.25 61.67±4.89a42.75±2.63b49.20±3.70abc43.33±2.89bd6.56±0.14 7.72±0.28a68.29±2.91a14.69±1.78ab36.15±3.07abc26.08±2.21abcdP （mmol/L）碱性磷酸酶（U/L）骨钙素（μg/L）

2.2各组大鼠血清OPG、RANK、RANKL水平比较与正常组比较，假手术组大鼠血清OPG和RANK水平略有上升，RANKL水平略有降低，模型组大鼠血清OPG 和RANK水平显著升高，RANKL水平显著降低，雌二醇组、生续断组和酒续断组大鼠血清OPG和RANK水平显著升高，RANKL水平显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，雌二醇组、生续断组和酒续断组OPG和RANK水平显著上升，RANKL水平显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与雌二醇组比较，生续断和酒续断组OPG和RANK水平显著降低，RANKL水平显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与生续断组比较，酒续断组OPG和RANK水平显著升高，RANKL水平显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2　各组大鼠血清OPG、RANK、RANKL水平比较（±s，n=5）

注：与正常组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与雌二醇组比较，cP＜0.05；与生续断组比较，dP＜0.05。

169.23±12.93 235.35±12.86a336.86±14.11a959.79±30.55ab462.93±25.27abc544.01±26.32abcdOPG （ng/L）0.37±0.02 0.42±0.03a0.64±0.03a1.84±0.11ab0.89±0.07abc1.11±0.06abcd328.93±27.05 268.07±15.68a228.28±12.01a76.84±4.27ab171.24±13.82abc120.63±9.73abcdRANK （pmol/L）RANKL （μg/L）组别正常组假手术组模型组雌二醇组生续断组酒续断组

3　讨论

续断始载于《本经》，味苦、辛，微温，归肝、肾经。续断的现代炮制方法主要有切片、酒炙、盐制、炒制、麸制、炭制等，2015年版《中国药典》收载3种在临床上使用广泛的饮片规格：生续断片、酒续断和盐续断［6］。续断生品补肝肾、通血脉、强筋骨，多用于筋骨疼痛。酒续断始载于《雷公炮炙论》，曰：“用酒浸一伏时，焙干用”，续断酒炙可引药向外行散，增强通血脉之功，多用于风湿痹痛，跌打损伤。续断的主要化学成分为皂苷和酚酸类化合物，现代药理学研究发现，续断具有抗骨质疏松作用，皂苷类成分是其主要抗骨质疏松成分［7-11］。

骨质疏松症是一种以骨量低下、骨微结构破坏、导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病。骨骼主要由胶原质和磷酸钙组成，胶原质是一种形成软组织的蛋白质，磷酸钙则是一种增加骨骼强度和增加软组织硬度的矿物质。常规与骨矿物质有关的生化检查包括血清游离钙、血清无机磷和血清镁等［12］。本研究发现，生续断和酒续断灌胃给药均能降低模型大鼠血钙水平，提高大鼠血清无机磷水平，酒续断灌胃给药引起的变化幅度大于生续断，说明生续断和酒续断灌胃给药有利于血清中的游离钙沉积形成骨骼。

骨生化标志物也是确定骨骼健康的一项重要指标［12］，如血清总碱性磷酸酶、骨钙素和Ⅰ型前胶原羧基端前肽等是反映骨形成的生化指标。碱性磷酸酶在机体中的主要生理功能是在成骨过程中水解磷酸酯，为羟基磷灰石的沉积提供必要的磷酸，同时水解焦磷酸盐，解除其对骨盐形成的抑制作用，有利于成骨作用。骨钙素主要由成骨细胞合成并分泌，比较稳定，不受骨吸收因素的影响。通过血清骨钙素可以了解成骨细胞，特别是新形成的成骨细胞的活动状态。骨转换加速是骨质疏松的一个特点，高骨转换率可导致骨重吸收超过骨形成，增加骨折风险。骨钙素水平随骨更新率的变化而变化，骨更新率越快，骨钙素水平越高，反之，则降低。原发性骨质疏松和绝经后骨质疏松是高转换型的，所以骨钙素明显升高；老年性骨质疏松症是低转换型的，因而骨钙素升高不明显。本研究发现，生、酒续断灌胃给药均能降低模型组大鼠血清碱性磷酸酶活性，降低血清骨钙素水平，说明生、酒续断灌胃可以降低骨转换率，减少骨质重吸收，且酒续断的作用更强。

骨骼的形态发生和重建包括2个对立统一的过程，即成骨细胞介导的骨基质合成过程和破骨细胞介导的骨吸收过程。OPG、RANK和RANKL形成的局部调节体系，在骨生长、发育及骨构塑和骨重建中起着十分重要的作用［4］。RANKL是破骨细胞分化所必需的细胞因子，促进破骨细胞前体细胞分化，诱导破骨细胞生成；RANK是RANKL的受体，二者结合后参与破骨细胞的分化，促进骨质的吸收；OPG主要由成骨细胞分泌，特异性消除膜结合的可溶性RANKL抑制破骨细胞生成和成熟破骨细胞的活性。本研究发现，生、酒续断灌胃给药均能显著提高模型大鼠血清OPG和RANK水平，降低RANKL水平，表明生、酒续断均能抑制破骨细胞生成，抑制骨质吸收。

综上所述，续断能够调控OPG/RANK/RANKL轴系统，促进成骨，抑制破骨，维持骨质疏松大鼠体内成骨和破骨活动的平衡，酒续断的调控力度大于生续断。

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