姜黄素在缺氧致视网膜神经节细胞氧化应激损伤中的作用及机制

裴　涌,郝旭红,孙晓楠

(沈阳市第四人民医院眼科,沈阳110031)

姜黄素在缺氧致视网膜神经节细胞氧化应激损伤中的作用及机制

裴涌,郝旭红,孙晓楠

(沈阳市第四人民医院眼科,沈阳110031)

目的观察姜黄素对缺氧致小鼠视网膜神经节细胞RGC-5氧化应激损伤的影响,并探讨其作用机制.方法以小鼠RGC-5细胞株为研究对象,按照不同处理因素将细胞随机分为4组:正常对照组、缺氧组、缺氧+溶剂(二甲基亚砜)对照组、缺氧+姜黄素预处理组.2′7′-二氯荧光素探针法检测细胞内活性氧自由基(ROS),四甲基偶氮唑蓝法检测细胞增殖活性,Western b1ot检测细胞内核转录因子Nrf2蛋白的表达,实时荧光定量RT-PCR检测醌氧化还原酶(NQO1)和血红素氧合酶1(HO-1)mRNA表达.结果与正常对照组相比,缺氧组细胞内ROS含量明显增高(P<0.05),细胞活性明显降低(P<0.05);而缺氧+姜黄素预处理组缺氧导致的细胞氧化应激损伤明显减轻,并且细胞内的Nrf2蛋白水平明显增加(P<0.05),NQO1和HO-1mRNA表达明显提高(P<0.05).结论姜黄素能够激活视网膜神经节细胞内Nrf2抗氧化通路,上调其介导的Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因NQO1和HO-1的转录活性,从而减轻缺氧导致的视网膜神经节细胞氧化应激损伤.

姜黄素;缺氧;视网膜神经节细胞;核转录因子Nrf2;氧化应激

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视网膜神经节细胞(retina1 gang1ion ce11,RGC)是视网膜最终端的神经元,在视觉信息的整合和传递中至关重要.缺血、缺氧诱发氧化应激导致RGC损伤、变性和凋亡,最终引起视觉功能丧失.姜黄素是从姜黄属中药姜黄、郁金、莪术等的块茎中提取出来的一种酚性色素,医学研究表明其具有抗炎、抗氧化、清除自由基、抗肿瘤等作用,但具体机制还不十分清楚.本研究建立了RGC-5缺氧模型,观察姜黄素对缺氧导致的RGC-5氧化应激损伤的影响,并探讨其作用机制,为预防和治疗RGC缺血、缺氧损伤提供实验依据.

1　材料与方法

1.1材料

小鼠RGC-5细胞株,购自美国ATCC细胞库.姜黄素、二甲基亚砜(dimethy1 su1foxide,DMSO)、二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯荧光探针(DCFH-DA)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、碱性磷酸酶标记的抗兔IgG和抗小鼠IgG,购自美国Sigma公司;胎牛血清、DMEM、Trizo1,购自美国Invitrogen公司;Nrf2、β-actin一抗,购自美国Santa Cruz公司;逆转录试剂盒及PCR扩增试剂盒,购自美国App1ied Biosystem公司.

1.2方法

1.2.1细胞培养及实验分组:用DMEM培养基(含10%胎牛血清、青霉素、链霉素100 U/mL),在37℃、5%CO2孵育箱内培养小鼠RGC-5细胞株,3～4 d传代1次.将细胞随机分为4组:正常对照组、缺氧组、缺氧+溶剂(DMSO)对照组、缺氧+姜黄素预处理组,其中缺氧+溶剂对照组是为了排除DMSO的干扰因素.缺氧模式将培养基更换为经缺氧处理(预先用氮气饱和)的无糖、无血清培养基,然后放入37℃、95%N2、5%CO2三气培养箱中6 h,之后更换含糖、含血清培养基,置于37℃、5%CO2孵育箱内继续培养4 h.缺氧+溶剂对照组和缺氧+姜黄素预处理组分别先给予含0.01%DMSO或10 μmo1/L姜黄素(用终浓度为0.01%DMSO配制)的培养基预处理6 h,再按上述给予缺氧处理.

1.2.2细胞内活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)含量测定:将细胞浓度调整为1X106个,加入终浓度10 μmo1/L的DCFH-DA,避光孵育30 min.PBS洗涤细胞3次,流式细胞仪检测荧光强度(激发波长485 nm,发射波长530 nm),以荧光强度反映细胞内ROS含量.

1.2.3细胞增殖活性测定:取各组细胞制成单细胞悬液,以5X103/孔接种到96孔细胞培养板中.培养24 h后,按上述各分组处理方法处理细胞后,终止培养.每孔加入MTT 20 μL(浓度为5 g/L),继续避光培养4 h,终止培养,小心弃上清,加入200 μL DMSO溶解MTT,在酶联免疫检测仪上测定波长为490 nm处各孔的吸光度.

1.2.4Western b1ot检测Nrf2蛋白表达:收集各组细胞,RIPA裂解液裂解细胞,离心收集上清.应用BSA方法测定蛋白浓度.选择4%～12%Tris-G1ycine凝胶进行电泳,转膜并加入Nrf2(1∶200)、β-actin (1∶1 000)一抗.二抗为碱性磷酸酶标记的抗兔IgG(1∶1 000)、抗小鼠IgG(1∶1 000).加入ECF底物进行荧光显色.采用Image J分析灰度值,以βactin作为内参照.

1.2.5实时荧光定量RT-PCR检测醌氧化还原酶[NAD(P)H quinone oxidoreduetase,NQO1]和血红素氧合酶1(heme oxygenase 1,HO-1)mRNA的表达:提取细胞总mRNA,按逆转录试剂盒说明书进行RNA逆转录反应合成cDNA.然后进行实时荧光定量PCR.所用引物序列:NQO1上游5′-TATCCTTCCG AGTCATCTCTAGCA-3′,下游5′-TCTGCAGCTTCC AGCTTCTTG-3′;HO-1上游5′-CCTCACTGGCAGG AAATCATC-3′,下游5′-CCTCGTGGAGACGCTTTAC ATA-3′;内参18S上游5′-CGAACGTCTGCCCTATC AACTT-3′,下游5′-CCGGAATCGAACCCTGATT-3′.由PCR曲线得到到达阈值时的循环数(cyc1e thresho1d,Ct)值,采用2-△△Ct方法进行相对定量分析.

1.3统计学分析

应用Graphpad Prism 5统计软件进行统计学分析.所有数据用±s表示.组间单比较采用单因素方差分析.P<0.05为差异有统计学意义.

2　结果

2.1细胞内ROS测定结果

与正常对照组相比,缺氧组细胞内ROS含量明显升高(P<0.05);缺氧+姜黄素预处理组与正常对照组相比细胞内ROS含量升高(P<0.05),但较缺氧组相比明显降低(P<0.05).缺氧+溶剂对照组与缺氧组比较,细胞内ROS生成无统计学差异.见表1.

表1　4组RGC⁃5细胞内ROS含量、细胞增殖活性、Nrf2蛋白、NQO1和HO⁃1 m RNA的表达Tab.1 Dete rm ination of ROS,cell viability,Nrf2 protein,NQO 1 and HO⁃1 mRNA of the re tinal ganglion cells in 4 groups

2.2细胞增殖活性的测定结果

与正常对照组相比,缺氧组细胞增殖活性明显降低(P<0.05);缺氧+姜黄素预处理组与正常对照组相比细胞增殖活性亦降低(P<0.05),但较缺氧组细胞增殖活性明显升高,差异有统计学意义(P< 0.05);缺氧+溶剂对照组与缺氧组比较,细胞活性无统计学差异.见表1.

2.3Western b1ot结果

Nrf2蛋白分子量约为100 000,β-actin分子量约为42 000.缺氧组RGC-5中Nrf2蛋白表达较正常对照组明显升高(P<0.05);缺氧+姜黄素预处理组Nrf2蛋白表达较缺氧组升高,差异有统计学意义(P<0.05).见图1,表1.

图1　4组RGC⁃5中Nrf2蛋白表达的W estern blo t结果Fig.1 Nrf2 protein expressions of the retinal ganglion ce lls in 4 groups

2.4实时荧光定量RT-PCR结果

缺氧组RGC-5中的NQO1和HO-1mRNA表达较正常对照组明显增加(P<0.05),而缺氧+姜黄素预处理组NQO1和HO-1mRNA表达较缺氧组升高,差异有统计学意义(P<0.05).见表1.

3　讨论

RGC是位于视网膜最终段的神经细胞,其轴索为视神经纤维.视网膜缺血、缺氧诱发的氧化应激,导致RGC进行性死亡,是许多视网膜和视神经疾病发展到最后的必经之路,如糖尿病视网膜病变、青光眼、视网膜中央动脉阻塞等[1,2].

姜黄素是从姜黄属中药姜黄、郁金、莪术等的块茎中提取出来的一种酚性色素,是联合国世界卫生组织/食品药品管理局批准的天然食品添加剂,在食品生产中主要用于肠类制品、罐头、酱卤制品等产品的着色.医学研究表明:姜黄素有抗氧化、抗炎、抗凝、抗动脉粥样硬化、抗衰老、消除自由基及抑制肿瘤生长等多种药理作用[3～5],但具体作用机制还有待研究.Nrf2抗氧化通路是氧化应激重要的调节途径,正常情况下Nrf2定位于细胞质中,与其抑制蛋白Keap1结合,当受到来源于ROS的攻击后Nrf2与Keap1解离,然后转位进入细胞核,与DNA上一段特异序列抗氧化反应元件结合,介导其下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的转录活性,如NQO1和HO-1,增强细胞清除活性氧自由基的能力,降低氧化应激对细胞、组织及器官的损伤[5,6].

本研究建立RGC缺氧模型,检测细胞内ROS生成、细胞增殖活性的情况.结果发现,RGC经缺氧处理后,细胞内ROS含量明显增加,细胞活性显著下降,表明缺氧能诱导氧化应激对RGC造成损伤.而给予姜黄素预处理6 h后能明显减轻缺氧诱发的细胞内ROS生成和细胞活性损伤,表明姜黄素能增强RGC的抗氧化应激能力,减轻缺氧引发的氧化应激损伤.为了进一步探讨姜黄素拮抗RGC氧化应激损伤的机制,我们检测了各组细胞Nrf2蛋白表达及其下游NQO1和HO-1的基因表达.实验结果表明,姜黄素的预处理能够使细胞内Nrf2蛋白及其下游调控的NQO1、HO-1 mRNA的表达增强,并显著高于单纯缺氧组.这些数据表明,姜黄素可以通过活化Nrf2-抗氧化反应元件途径参与拮抗RGC的氧化应激损伤,也为姜黄素在预防和治疗视网膜缺血、缺氧导致的神经节细胞氧化应激损伤提供了可能的治疗靶点和途径.

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(编辑陈姜)

EffectofCurcum in on Hypoxia-induced OxidativeStress Injury ofRetinalGanglion Cells

PEIYong,HAOXu-hong,SUNXiao-nan
(DepartmentofOphtha1mo1ogy,ShenyangThe FourthHospita1ofPeop1e,Shenyang110031,China)

Objective To investigate the ro1e of curcumin on the hypoxia-induced oxidative stress damages of retina1 gang1ion ce11s and exp1ore the re1ated mechanism.M ethods The retina1 gang1ion ce11s of mouse were divided into 4 groups as fo11ows:contro1 group,hypoxia group,hypoxia+ DMSOgroup,and hypoxia+curcumingroup.The reactiveoxygen species(ROS)in ce11swasmeasured by theDCFH-DA probe.Thece11growth viabi1ity was detected by MTT assay.The protein expression of Nrf2 was determined by Western b1ot.The mRNA expressions of NQO1 and HO-1 were measured by rea1-timeRT-PCR.Results Comparedwith contro1group,thece11u1arROSwasincreasedsignificant1y(P<0.05)and thece11viabi1-ity decreased marked1y(P<0.05)in hypoxia group.Pretreatment with curcumin cou1d marked1y inhibit the hypoxia-induced oxidative stress damages of retina1 gang1ion ce11s.Compared with hypoxia group,curcumin pretreatment cou1d remarkab1y increase the 1eve1 of Nrf2 protein(P<0.05) and a1sothe NQO1 and HO-1mRNA(P<0.05).Conclusion Curcumin pretreatmentcou1d activateNrf2 pathway,and thenup-regu1ate the transcription of the downstream phaseⅡdetoxifying enzymes and antioxidant enzymes,such as NQO1 and HO-1,and fina11y inhibit hypoxia-induced oxidativestressdamagesof retina1gang1ionce11s,

curcumin;hypoxia;retina1 gang1ion ce11s;Nrf2;oxidative stress

R774.1

A

0258-4646(2016)03-0227-03

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.03.009

辽宁省自然科学基金(2014020184)

裴涌(1975-),男,副主任医师,硕士. E-mai1:peiyong75@163.com

2015-09-28

网络出版时间: