黄芩镇静作用有效组分的筛选

苑艺蕾，汪　娜，王洪玉，卢　芳，刘树民

（1.黑龙江中医药大学药物安全性评价中心，哈尔滨150040；2.黑龙江省高等院校中药基本理论研究科技创新团队，哈尔滨150040；3.齐齐哈尔医学院，齐齐哈尔161000）

黄芩镇静作用有效组分的筛选

苑艺蕾1，2，汪娜3，王洪玉1，2，卢芳1，2，刘树民1，2

（1.黑龙江中医药大学药物安全性评价中心，哈尔滨150040；2.黑龙江省高等院校中药基本理论研究科技创新团队，哈尔滨150040；3.齐齐哈尔医学院，齐齐哈尔161000）

筛选出黄芩中具有镇静作用的有效组分.昆明种小鼠分为D101 30组、D101 95组、黄芩多糖组、黄芩挥发油组以及黄芩高低剂量组六组，观察对小鼠自主活动的影响，戊巴比妥钠域上、域下剂量致小鼠入睡的影响，并运用聚类分析的统计学方法对数据进行进一步的处理分类.通过各有效组分与空白组比较以及分层聚类分析的数据处理方法，得出黄芩D101 30组和D101 95组具有显著性镇静作用.黄芩D101 30和D101 95组分具有更为显著的镇静作用.

黄芩；镇静；有效部位；聚类分析

黄芩为唇形科植物Scutellaria baicalensis Georg的干燥根，《中国药典》中记述“黄芩苦寒，归肺、胆、脾、大肠、小肠经，具有清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎的功效［1］.黄芩在古代医学典籍中，并未有明确的镇静安神功效的记载，但其在配伍中常与治疗清热安神和疏肝安神等的方书中使用，对治疗镇静安神、清热解毒和肝郁火型失眠均有一定的治疗效果［2-3］.在现代药理学的研究中表明，黄芩苷具有一定的清热镇静的作用［4-5］.而黄芩的各有效组分是否具有镇静作用，却没有进一步具体的分析研究，本实验旨在对黄芩镇静作用中各组分的有效性进行筛选，并初步探讨其作用机制.

1　材料

1.1药物

1.2动物

SPF级昆明种小鼠320只，雌雄各半，体重18 ～22 g（由黑龙江中医药大学安全评价中心提供，批号SCXK黑2013-004）.

1.3仪器

KDC-160HR高速冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；电子数字式温度计MC -612型（欧姆龙有限公司）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；KQ-50B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ZZ-6型自主活动仪（成都泰盟软件有限公司），MK3型酶标仪（赛默飞世尔仪器有限公司）等.

1.4供试药品的制备

取黄芩500 g，超声浸泡石油醚中，得挥发油成分；生药第1次加10倍量水煎煮1 h，第2次加8倍量水煎煮1 h，合并煎液，浓缩至适量［6］，加95%乙醇调至醇体积分数85%，静置24 h，滤过，精制沉淀得多糖部位.取上清液浓缩至适量，过D101大孔树脂，分别加3倍柱体积的30%乙醇，95%乙醇洗脱，将各洗脱液浓缩冻干，黄芩的全部成分拆分为4个组分：即脂肪油组分，提取率为2.62%、多糖组分、D101 30醇组分和D101 95组分（主要为苷元类）.多糖组分主要含有黄芩多糖，提取率为27.94%；D101 30醇组分主要含有黄酮苷类（黄芩苷、汉黄芩苷等）和环烯醚萜类等苷类物质，提取率为27.4%；D101 95组分主要含有黄酮苷元类（黄芩素、汉黄芩素等）等苷元类物质，提取率为3. 48%.（见图1）.

图1　黄芩各拆分组分分离流程图

2　方法

2.1对小鼠自主活动次数的影响［7］

我在那个晚上极其无聊，我先去找沈天祥，沈天祥的母亲说他中午出门以后一直没有回来，我又去找王飞，王飞躺在床上面红耳赤，他被四十度的高热烧得头昏脑胀。最后我去了陈力庆的家，陈力庆正拍着桌子在和他父亲吵架，我的脚都没有跨进陈力庆的家门，我不愿意把自己卷进别人的争吵之中，尤其是父子之间的争吵。

取昆明种小鼠80只，随机分成8组，每组10只，雌雄各半.分为空白对照组，（给予同容积的蒸馏水），地西泮组（4 mg/kg），黄芩低剂量组（3 g生药/kg），黄芩高剂量组（12 g生药/kg），黄芩D101 30组，黄芩D101 95组，黄芩多糖组，黄芩挥发油组，四个组分组给药量按照低剂量组的生药量转换，给药体积为1.0 mL/.每天灌胃1次，连续7 d.于末次给药前8 h禁食，前1 h禁水，给药30 min后将小鼠置于自主活动仪中，每只5 min，每测完一只，应将暗箱彻底清理及擦拭，以免影响实验结果.各组小鼠眼眶取血3 500 r/min离心10 min，取血清，测NO、NOS的浓度.

2.2对戊巴比妥钠阈上剂量致小鼠睡眠时间的影响［8］

动物分组及给药方法同上.于末次给药前8 h禁食，前1 h禁水，给药30 min后腹腔注射戊巴比妥钠35 mg/kg，观察并记录各组小鼠睡眠潜伏期及睡眠持续时间.

2.3对戊巴比妥钠阈下剂量致小鼠睡眠时间的影响［8］

动物分组及给药方法同上.于末次给药前8 h禁食，前1 h禁水，给药30 min后腹腔注射戊巴比妥钠45 mg/kg，观察并记录各组小鼠睡眠潜伏期及睡眠持续时间.

2.4统计学处理

3　结果

3.1对小鼠自主活动次数的影响

与空白组比较，各组分的活动次数减少，其中D101 95组，多糖组和黄芩高剂量组有显著性差异（P＜0.05），D101 30组和黄芩低剂量组有极显著性差异（P＜0.01）；各组分的站立次数减少，其中D101 30组，D101 95组和挥发油组均有显著性差异（P＜0.05），多糖组和黄芩高剂量组有极显著性差异（P＜0.01），表明黄芩各组分对自主活动次数有不同程度的降低的作用（见表1）.与空白组比较，其中黄芩D101 30，D101 95，多糖和黄芩高剂量组小鼠血清NO浓度有显著性差异（P＜0.05）；黄芩D101 95和多糖组小鼠血清NOS浓度有显著性差异（P＜0.05），黄芩高剂量组和挥发油组有极显著性差异（P＜0.01）（见表2）.

表1　小鼠自主活动次数的比较±S，n=10）

表1　小鼠自主活动次数的比较±S，n=10）

注：与空白组比较*P＜0.05，与空白组比较＊＊P＜0.01

29.14±6.12　80.5±11.32 D101 30　15.1±4.79＊＊　69.38±8.43*D101 95　19.8±8.44*　66.4±15.3*多糖　21.2±6.7*　58.7±16.78＊＊挥发油　23.3±8.47　70.2±9.3*芩低　21.4±4.7＊＊　68.9±22芩高　19.2±8.95*　58.3±18＊＊阳性　20.57±5.91*　58.71±16.15活动次数　站立次数空白＊＊

表2　各组小鼠血清NO、NOS的比较（±S，n=10）

表2　各组小鼠血清NO、NOS的比较（±S，n=10）

注：与空白组比较*P＜0.05，与空白组比较＊＊P＜0.01

NO/（mol·L-1）　NOS/（mol·L-1）7.685±0.1　2.752±0.361 D101 30　8.722±0.998*　3.084±0.215 D101 95　8.613±0.874*　3.37±0.524*多糖　8.318±0.637*　3.124±0.343*挥发油　8.357±0.867　3.399±0.581＊＊芩低　8.265±1.044　2.961±0.525芩高　8.677±1.012*　3.444±0.588＊＊阳性　8.71±0.723＊＊　3.349±0.497空白＊＊

3.2对阈上剂量致小鼠睡眠时间的影响

与空白组比较，黄芩D101 30组、D101 95组、黄芩低剂量组、高剂量组和挥发油组的睡眠潜伏期缩短，睡眠时间明显延长，具有显著性和极显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），表明黄芩D101 30、D101 95、黄芩低剂量、高剂量组及挥发油组具有催眠作用（见表3）.

表3　阈上剂量戊巴比妥钠致动物睡眠和睡眠时间的比较（±S，n=10）

表3　阈上剂量戊巴比妥钠致动物睡眠和睡眠时间的比较（±S，n=10）

注：与空白组比较*P＜0.05，与空白组比较＊＊P＜0.01

7.24±1.09　18.01±2.8 D101 30　5.51±1.28＊＊　23.25±6.14*D101 95　5.84±1.71*　22.31±2.56＊＊多糖　6.14±2.47　15.92±9.36挥发油　4.66±2.03＊＊　16.9±6.45芩低　4.41±1.26＊＊　23.5±4.14＊＊芩高　4.77±1.09＊＊　24.28±6.93*阳性　3.75±1.56＊＊　61.85±3.89 /min空白潜伏期/min　睡眠时间＊＊

3.3对阈下剂量致小鼠睡眠时间的影响

与空白组比较，黄芩D101 30、D101 95、多糖组、黄芩低剂量组、高剂量组和挥发油组的睡眠潜伏期缩短，睡眠时间明显延长，具有显著性和极显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），表明黄芩D101 30、D101 95、多糖组、黄芩低剂量、高剂量组及挥发油组具有催眠作用（见表4）.

表4　阈下剂量戊巴比妥钠致动物睡眠和睡眠时间的比较（±S，n=10）

表4　阈下剂量戊巴比妥钠致动物睡眠和睡眠时间的比较（±S，n=10）

注：与空白组比较*P＜0.05，与空白组比较＊＊P＜0.01

12.13±2.87　6.62±6.1 D101 30　7.99±3.47＊＊　13.73±2.76*D101 95　11.98±0.84　27.971±17.41＊＊多糖　9.64±4.35　17.31±13.08*挥发油　8.61±3.22*　10.55±5.68芩低　8.52±2.61＊＊　20.09±4.35*芩高　7.7±3.61＊＊　15.64±10.94*阳性　7.66±2.16＊＊　17.1±5.86 /min空白潜伏期/min　睡眠时间＊＊

4　分层聚类分法对镇静睡眠各有效组分进行归纳处理

通过对表1～4的数据分析结果观察到，黄芩的各个有效组分均有一定程度的镇静睡眠作用，这对于筛选有效组分存在一定的局限性，也不易于进一步的分析［9］，因此，本实验大胆的采用聚类分析的处理方法，将各组分进行归类分析，以达到有效组分筛选的目的.

本实验采用的是分层聚类分析法，其检测结果见图2、表5.将各组分依次从空白、D101 30、D101 95、多糖、挥发油、芩低、芩高和阳性组分按1～8号排序，从图2中可以看出，黄芩各有效组分一共8组，可聚成3大类，样品4、5、6、7号样品间的距离最小（5～6），可归为一类，样品2、3、8号间的距离相近（11～15），可归为一类，样品1号的距离大于15，可归为一类.由图1可以看出，这三类样品的距离有一定差距，因此这三类之间具有差异性.8号为阳性对照组，其对于镇静睡眠作用的效果为最佳，而2号D101 30组分和3号D101 95组分与阳性对照组在同一类，因此，可以推断在黄芩干预镇静睡眠的药理作用中，D101 30组分和D101 95组分的治疗效果最佳.

表5　分层聚类分析详细步骤

图2　分层聚类分析树状图

5　讨论

本实验结果表明，黄芩的各有效组分，均有不同程度的镇静作用.在镇静试验中，通过对NO、NOS浓度的测定，初步探讨黄芩各有效组分的作用机制.NO是中枢神经系统内重要的神经递质，参与包括学习、记忆在内的多种生理过程［10］.实验研究表明NO是血管细胞中的一氧化氮合酶利用L-精氨酸合成的一种强效扩血管物质，能快速弥散进入平滑肌细胞，引起血管松弛［11］.实验结果显示，黄芩的D101 30、D101 95、多糖组、挥发油组、高剂量组等显著提高NO、NOS的浓度，表明上述组分可能对血管扩张有一定的促进作用，从而起到一定的镇静作用.

由于在上述实验中，各组分的均有不同程度的差异性，因此，通过分层聚类分析的处理方法，对各组数据进行进一步的分析处理，可以得出D101 30 和D101 95组分的镇静作用最为显著，从图1可以看出，这两个组分是相对独立的，成分是具有明显差异性的，但都具有明显的镇静作用，造成这一现象的原因可推断为，推论1：在提取分离的时候，存在成分交叉的可能，即存在相同的化合物，这种化合物对镇静作用最为显著；推论2：黄芩中主要成分为黄酮类化合物，但在本实验中起到镇静作用的可能为未知化合物，是否存在及其是否对镇静有一定功效都有待日后的进一步研究；推论3：黄芩的D101 30部位的主要成分为黄芩苷类，而D101 95部位的主要成分为黄芩苷元类，有文献记载，黄芩苷类进入体内可以与葡萄糖醛酸结合生成苷元，而苷元在体内亦可脱去葡萄糖醛酸而水解得到黄芩苷类化合物，其在体内后的变化是可逆的，由此可推断，D101 30和D101 95组分，虽然前者为水溶性的，后者为脂溶性的，但是也存在D101 30和D101 95组分均对镇静作用功效最为显著的可能.

综上所述，黄芩镇静作用的实验中，D101 30 和D101 95两个组分均更为显著的治疗效果，但究其原因，还有待于进一步的探讨与深入的研究.

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Selecting effective com ponent in sedative effect of Scutellaria baicalensis georgi

YUAN Yi-lei1，2，WANG Na3，WANG Hong-yu1，2，LU Fang1，2，LIU Shu-min1，2
（1.Institute of Traditional Chinese Medicine，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China；2.Heilongjiang Province Universities of TCM Basic Theory Research and Technology Innovation Team，Harbin 150040，China；3.Qiqihar Medical College，Qiqihar 161000）

To select the effective component of Scutellaria baicalensis georgi sedating，the mice were divided into six groups，D101 30 group，D101 95 group，Scutellaria polysaccharide group，Scutellaria volatile oil group，Scutellaria low-dose group and Scutellaria highdose group.The effect on the spontaneous activity ofmice and the effect of sodium pentobarbital in high domain and low domain on sleepingwere observed.The cluster analysis statisticalmethod was used for classification of data further processing.Through the effective components and blank group and hierarchical cluster analysis，it was concluded that Scutellaria D101 30 group and D101 95 groups have significant sedative effection.The Scutellaria D101 and 30 D101 95 components have amore significant sedation.

Scutellaria baicalensis georgi；sedation；effective parts；cluster analysis

R284

A

1672-0946（2016）02-0132-04

2015-04-22.

国家重点基础研究发展计划973计划（2013CB531804）

苑艺蕾（1989-），女，硕士，研究方向：中药药性理论.

刘树民（1963-），男，博士生导师，研究方向：中药药性理论研究.